檢(jiǎn)測原(yuán)理
試(shì)劑(jì)盒(hé)采用(yòng)雙抗體一步夾(jiā)心(xīn)法酶(méi)聯(lián)免疫吸(xī)附(fù)試(shì)驗（ELISA）。往預(yù)先包被(bèi)人鈣衛(wèi)蛋(dàn)白（Calprotectin）捕(bǔ)獲抗體的包被(bèi)微(wēi)孔(kǒng)中，依次加入標本(běn)，標準(zhǔn)品(pǐn)，HRP標記的檢測(cè)抗體(tǐ)，經(jīng)過(guò)溫(wēn)育並徹(chè)底(dǐ)洗(xǐ)滌。用底(dǐ)物(wù)TMB顯(xiǎn)色，TMB在過氧化(huà)物(wù)酶的催(cuī)化下轉化成藍色，並在酸的(dí)作用下轉化成最終的黃色(sè)。顏色的(dí)深淺和樣(yàng)品(pǐn)中(zhōng)的人鈣衛蛋白(bái)（Calprotectin）呈正相關。用酶(méi)標(biāo)儀在450nm 波(bō)長下測定(dìng)吸光(guāng)度（OD 值(zhí)），計(jì)算(suàn)樣品(pǐn)濃度。
樣品(pǐn)收集(jí)，處理及(jí)保(bǎo)存(cún)方法(fǎ)
1.  血(xiě)清：使(shǐ)用不(bù)含熱原和內(nèi)毒素的(dí)試(shì)管(guǎn)，操作過程中避(bì)免任(rèn)何細胞刺激，收(shōu)集(jí)血液(yè)後，3000轉(zhuǎn)離心(xīn)10分鐘(zhōng)將血(xiě)清和紅細胞迅速(sù)小心地(dì)分離。
2.  血漿(jiāng)：EDTA，檸檬(méng)酸(suān)鹽(yán)或肝(gān)素抗(kàng)凝。3000轉(zhuǎn)離心30分(fēn)鐘取上(shàng)清。
3.  細(xì)胞(bāo)上清液：3000轉(zhuǎn)離(lí)心10分鐘去除顆粒和聚合物(wù)。
4.  組織匀(yún)漿(jiāng)：將組織加(jiā)入適量(liáng)生理(lǐ)鹽水搗碎(suì)。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取(qǔ)上清(qīng)。
5.  保(bǎo)存(cún)：如(rú)果樣本收集(jí)後(hòu)不(bù)及(jí)時檢(jiǎn)測(cè)，請(qǐng)按(àn)一次用量分(fēn)裝，凍存於(yú)-20℃，避(bì)免(miǎn)反復凍融，在室溫(wēn)下解(jiě)凍並確保(bǎo)樣品(pǐn)均(jūn)匀(yún)地(dì)充(chōng)分(fēn)解凍。
自備物品(pǐn)
1.     酶(méi)標儀（450nm）
2.     高精度加樣器及(jí)槍頭：0.5-10uL，2-20uL，20-200uL，200-1000uL
3.     37℃恒溫箱
操(cāo)作注意(yì)事(shì)項(xiàng)
1.  試劑(jì)盒(hé)保存(cún)在(zài)2-8℃，使用(yòng)前室溫平(píng)衡20分鐘(zhōng)。從(cóng)冰(bīng)箱取(qǔ)出的濃(nóng)縮(suō)洗滌液會(huì)有(yǒu)結(jié)晶(jīng)，這屬(shǔ)於正常現(xiàn)象，水浴(yù)加(jiā)熱使(shǐ)結(jié)晶(jīng)完(wán)全(quán)溶(róng)解後(hòu)再使用(yòng)。
2.  實驗中不用的(dí)板條(tiáo)應立即放回(huí)自(zì)封袋中，密封(fēng)（低(dī)溫幹燥）保存。
3.  標(biāo)準品(pǐn)稀釋液即(jí)可(kě)視為(wéi)陰性對照(zhào)或者(zhě)空白
；預(yù)處(chǔ)理(lǐ)後的(dí)樣(yàng)本(běn)無(wú)需稀釋(shì)，直接(jiē)取(qǔ)10μL加樣(yàng)即(jí)可。
4.  嚴格(gé)按照說(shuō)明書中標明(míng)的時(shí)間，加(jiā)液量(liáng)及順(shùn)序(xù)進行溫育操作。
5.  所(suǒ)有液(yè)體組(zǔ)分(fēn)使用前充分(fēn)搖匀。
試(shì)劑(jì)盒組成(chéng)
名稱(chēng) 96孔(kǒng)配(pèi)置 48孔(kǒng)配(pèi)置 備(bèi)注(zhù)
微(wēi)孔(kǒng)酶標(biāo)板 12孔×8條 12孔(kǒng)×4條(tiáo) 無
標(biāo)準品（120μg/g） 0.6mL 0.6mL 按說(shuō)明(míng)書進行稀(xī)釋
標準品稀釋液 6mL 3mL 無(wú)
樣本(běn)稀釋(shì)液 6mL 3mL 無(wú)
檢(jiǎn)測抗體(tǐ)-HRP 10mL 5mL 無
20×洗滌緩(huǎn)衝液 25mL 15mL 按說明書進行(háng)稀釋(shì)
底物A 6mL 3mL 無
底(dǐ)物B 6mL 3mL 無(wú)
終(zhōng)止(zhǐ)液 6mL 3mL 無
封板(bǎn)膜 2張(zhāng) 2張 無
說(shuō)明(míng)書(shū) 1份(fèn) 1份 無
自封袋(dài) 1個(gè) 1個(gè) 無
注：標準(zhǔn)品(pǐn)用標(biāo)準品稀(xī)釋液依(yī)次(cì)稀釋為(wéi)：120，60，30，15，7.5，3.75 μg/g
試劑(jì)的準備
 20×洗滌(dí)緩(huǎn)衝(chōng)液(yè)的稀(xī)釋(shì)：蒸餾水(shuǐ)按1：20稀(xī)釋，即(jí)1份的(dí)20×洗滌(dí)緩衝液加(jiā)19份(fèn)的蒸餾(liù)水。
洗板方法
1.  手工洗(xǐ)板：甩盡孔內液(yè)體(tǐ)，每孔加滿(mǎn)洗(xǐ)滌液，靜置(zhì)1min後甩盡(jìn)孔內液體(tǐ)，在吸(xī)水紙上拍(pāi)幹，如(rú)此(cǐ)洗(xǐ)板5次。
2.  自動洗板機(jī)：每孔(kǒng)注(zhù)入(rù)洗液(yè)350μL，浸泡(pào)1min，洗(xǐ)板5次(cì)。
操作(zuò)步驟
1.  從(cóng)室(shì)溫平(píng)衡(héng)20min後(hòu)的(dí)鋁(lǚ)箔袋(dài)中取(qǔ)出(chū)所需板(bǎn)條(tiáo)，剩餘(yú)板條(tiáo)用(yòng)自(zì)封(fēng)袋(dài)密封放回(huí)4℃。
2.  設(shè)置標準(zhǔn)品孔(kǒng)和樣(yàng)本(běn)孔，標準(zhǔn)品(pǐn)孔(kǒng)各加不(bù)同(tóng)濃(nóng)度(dù)的標準品50μL
；
3.  待(dài)測樣本(běn)孔(kǒng)先加待測樣本10μL，再加(jiā)樣(yàng)本稀釋(shì)液40μL
；
4.  隨後標(biāo)準(zhǔn)品(pǐn)孔(kǒng)和樣本(běn)孔中每(měi)孔加(jiā)入辣(là)根過氧化(huà)物(wù)酶(méi)（HRP）標(biāo)記的(dí)檢測抗體(tǐ)100μL，用封(fēng)板膜封(fēng)住反(fǎn)應孔(kǒng)，37℃水(shuǐ)浴鍋(guō)或恒(héng)溫(wēn)箱(xiāng)溫(wēn)育60min。
5.  棄去液體(tǐ)，吸水(shuǐ)紙上拍(pāi)幹(gān)，每(měi)孔加(jiā)滿(mǎn)洗(xǐ)滌(dí)液(yè)，靜置(zhì)1min，甩(shuǎi)去洗滌(dí)液(yè)，吸水紙(zhǐ)上拍(pāi)幹(gān)，如此(cǐ)重復洗板5次（也(yě)可用洗板(bǎn)機洗(xǐ)板(bǎn)）。
6.  每(měi)孔(kǒng)加(jiā)入(rù)底(dǐ)物A，B各(gè)50μL，37℃避(bì)光(guāng)孵(fū)育(yù)15min。
7.  每孔(kǒng)加入(rù)終(zhōng)止液50μL，15min內，在450nm波(bō)長處測(cè)定各孔的OD值。
結(jié)果判(pàn)斷
 繪(huì)製(zhì)標準(zhǔn)曲(qū)綫(xiàn)：在Excel工作表(biǎo)中(zhōng)，以(yǐ)標(biāo)準品(pǐn)濃度作橫坐(zuò)標，對(duì)應(yīng)OD值作縱(zòng)坐(zuò)標，繪(huì)製出(chū)標(biāo)準(zhǔn)品綫(xiàn)性回(huí)歸(guī)曲綫(xiàn)，按曲(qū)綫方(fāng)程計算各樣本濃度(dù)值(zhí)。
試劑(jì)盒(hé)性能(néng)
1.  準確性：標準品綫(xiàn)性回歸(guī)與(yǔ)預(yù)期濃度相關(guān)係(xì)數(shù)R值，大於等於0.9900。
2.  靈(líng)敏度：最低檢測(cè)濃(nóng)度小於1.0μg/g。
3.  特(tè)異(yì)性：不與(yǔ)其(qí)它可(kě)溶性(xìng)結構(gòu)類似(sì)物(wù)交(jiāo)叉(chā)反(fǎn)應。
4.  重(zhòng)復性(xìng)：板內，板間(jiān)變異係數(shù)均小於15%。
5.  貯藏：2-8℃，避光(guāng)防潮保(bǎo)存。
6.  有效期(qī)：6個月(yuè)
免(miǎn)責聲(shēng)明
1.   試劑盒(hé)僅供(gōng)研究使用，不(bù)得用(yòng)於臨(lín)床實驗(yàn)或人體實(shí)驗，否則(zé)所產生的(dí)一切後果，由(yóu)實驗者(zhě)承擔，本公司(sī)概不負(fù)責(zé)。
2.   嚴格按照(zhào)說(shuō)明書操作(zuò)，實(shí)驗(yàn)者違(wéi)反(fǎn)說(shuō)明書操作(zuò)，後果由實驗者(zhě)承擔(dān)。