產(chǎn)品特(tè)征:
 
靈敏度高：能(néng)對低(dī)拷(kǎo)貝或多樣(yàng)性(xìng)模(mó)板進(jìn)行定(dìng)量(liáng)。
特(tè)異性強：采用(yòng)熱(rè)啟動酶(méi)的激活(huó)機製，抑製非特異(yì)性擴(kuò)增(zēng) 。
重復性好：擴增(zēng)曲(qū)綫(xiàn)重(zhòng)合度(dù)高，受幹擾(rǎo)影響少(shǎo)。
擴(kuò)增效率高(gāo)：擴(kuò)增曲綫(xiàn)Ct值低(dī)，起峰快(kuài)，效(xiào)率(shuài)高(gāo)。
原理:
所謂(wèi)實時(shí)熒光定量PCR技術，是(shì)指在(zài)PCR反(fǎn)應體係(xì)中加入熒光(guāng)基團，利用熒光(guāng)信號積累實時(shí)監測(cè)整個PCR進(jìn)程(chéng)，後(hòu)通(tōng)過標準曲(qū)綫對(duì)未(wèi)知模板(bǎn)進行(háng)定(dìng)量(liáng)分(fēn)析(xī)的(dí)方法。
需要自備的器(qì)材：
1．儀器：分析(xī)天平(píng)，離心機，熒光(guāng) PCR 擴增儀，組(zǔ)織研(yán)磨器(qì)，-20 ℃冰箱(xiāng)，可調移液(yè)器(qì)（2 µL，20µL，200 µL，1000 µL）。
2．耗材(cái)：熒(yíng)光(guāng) PCR 反應(yīng)管(guǎn)，眼科剪，眼科(kē)鑷，生理鹽水，1.5 mL 經焦(jiāo)碳酸二(èr)乙酯(zhǐ)（DEPC）水(shuǐ)
處(chǔ)理的(dí)滅(miè)菌離心管(guǎn)，吸頭（10 µL，200 µL，1000 µL），滅菌雙(shuāng)蒸水。
具有(yǒu)下列特(tè)點：
1.產品(pǐn)僅用(yòng)於科研即(jí)開即用(yòng)，用(yòng)戶隻(zhī)需(xū)要提供(gōng)樣品 DNA 模(mó)板，操作(zuò)簡(jiǎn)單(dān)，定(dìng)量(liáng)準確(què)快速。
2. 引物經(jīng)過優(yōu)化(huà)，特(tè)異性(xìng)強。預期(qī)的(dí) PCR 產物長(cháng)度為(wéi) 560 bp。
3. PCR mix 中含上樣染(rǎn)料，PCR 後可(kě)以直(zhí)接上(shàng)樣電泳。
4. 提(tí)供陽(yáng)性(xìng)對照，便(biàn)於分(fēn)析(xī)試驗(yàn)結果。
檢測(cè)方法：
1.Ⅰ法：
在PCR反應體(tǐ)係(xì)中，加入(rù)過量SYBR熒(yíng)光(guāng)染料，SYBR熒(yíng)光(guāng)染料(liào)特異性地(dì)摻(chān)入(rù)DNA雙(shuāng)鏈後(hòu)，發射熒光信(xìn)號，而不摻入(rù)鏈中的SYBR染料(liào)分子不(bù)會(huì)發(fā)射(shè)任何(hé)熒光(guāng)信號，從而(ér)保證(zhèng)熒(yíng)光信(xìn)號的增(zēng)加與PCR產(chǎn)物的(dí)增(zēng)加wan全同(tóng)步(bù)。
定量PCR擴(kuò)增(zēng)熒(yíng)光(guāng)曲綫(xiàn)圖(tú)
PCR產(chǎn)物熔(róng)解曲(qū)綫圖
2.TaqMan探針法：
探(tàn)針(zhēn)完整時，報(bào)告基(jī)團發(fā)射的熒光信號被(bèi)淬滅基團吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的(dí)5’-3’外切酶(méi)活性將探針(zhēn)酶切降(jiàng)解，產(chǎn)品僅用(yòng)於(yú)科(kē)研(yán)使(shǐ)報(bào)告熒(yíng)光基(jī)團和淬滅(miè)熒(yíng)光基(jī)團(tuán)分(fēn)離(lí)，從而熒光監(jiān)測係統可(kě)接收到(dào)熒(yíng)光信(xìn)號，即每(měi)擴增一(yī)條DNA鏈(liàn)，就(jiù)有一(yī)個(gè)熒(yíng)光分(fēn)子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產物的形成(chéng)wan全(quán)同步(bù)。
熒光(guāng)定量(liáng)PCR實(shí)驗(yàn)步驟：
①取凍存已裂(liè)解的細胞(bāo)，室溫放(fàng)置5分鐘(zhōng)使(shǐ)其wan全溶解(jiě)。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解(jiě)的樣(yàng)品中加入0.2ml的lvfang，蓋緊(jǐn)管(guǎn)蓋(gài)。手動(dòng)劇烈振蕩(dàng)管(guǎn)體15秒(miǎo)後(hòu)，15到30℃孵育2到3分鐘(zhōng)。4℃下(xià)12000rpm離心15分(fēn)鐘(zhōng)。離心後混(hùn)合液(yè)體將分為下層的(dí)紅色酚lvfang相，中間層以及無(wú)色水(shuǐ)相上(shàng)層。RNA全(quán)部被(bèi)分(fēn)配於(yú)水(shuǐ)相中(zhōng)。水相上(shàng)層的體(tǐ)積(jī)大(dà)約是(shì)匀(yún)漿時加(jiā)入的TRIZOL試劑(jì)的60%。
③RNA沉澱(diàn) 將(jiāng)水(shuǐ)相上層轉移到(dào)一幹(gān)淨(jìng)無RNA酶(méi)的離心(xīn)管(guǎn)中。加等體積異(yì)丙醇(chún)混(hùn)合以沉澱其(qí)中(zhōng)的RNA，混(hùn)匀(yún)後(hòu)15到30℃孵(fū)育(yù)10分(fēn)鐘後(hòu)，於4℃下12000rpm 離心(xīn)10分鐘。此(cǐ)時(shí)離心(xīn)前(qián)不可見(jiàn)的RNA沉澱(diàn)將在管(guǎn)底(dǐ)部(bù)和側(cè)壁(bì)上(shàng)形(xíng)成膠狀(zhuàng)沉澱塊。
④RNA清(qīng)洗 移(yí)去(qù)上清液，每1mlTRIZOL試(shì)劑(jì)裂解(jiě)的樣品中加(jiā)入至少1ml的75%乙(yǐ)醇(75%乙醇(chún)用DEPCH2O配製(zhì))，清(qīng)洗RNA沉澱。混匀(yún)後(hòu)，4℃下(xià)7000rpm離(lí)心5分鐘(zhōng)。
⑤RNA幹(gān)燥 小(xiǎo)心吸(xī)去大(dà)部(bù)分乙醇溶(róng)液(yè)，使RNA沉澱(diàn)在室溫空氣(qì)中幹燥(zào)5-10分鐘。
⑥溶解(jiě)RNA沉(chén)澱(diàn) 溶(róng)解RNA時，先加入(rù)無RNA酶的(dí)水40μl用槍(qiāng)反復吹(chuī)打幾次(cì)，使其(qí)wan全(quán)溶(róng)解(jiě)，獲(huò)得(dé)的(dí)RNA溶(róng)液保(bǎo)存於-80℃待(dài)用。 1)紫外(wài)吸(xī)收法(fǎ)測定(dìng)先用稀(xī)釋用的TE溶液將(jiāng)分(fēn)光(guāng)光度計(jì)調零(líng)。然(rán)後取(qǔ)少量(liáng)RNA溶液用(yòng)TE稀釋(1:100)後，讀取(qǔ)其(qí)在(zài)分(fēn)光(guāng)光(guāng)度(dù)計260nm和280nm處(chǔ)的(dí)吸(xī)收(shōu)值，測定RNA溶液 濃(nóng)度和(hé)純度(dù)。反(fǎn)應(yīng)五要(yào)素：
斯氏分(fēn)枝(zhī)杆菌(jūn)PCR檢測試劑盒費用參(cān)加(jiā)PCR反應(yīng)的物質主要(yào)有五種即引(yǐn)物，酶(méi)，dNTP，模板(bǎn)和Mg2+
引物(wù)：引(yǐn)物是PCR特(tè)異(yì)性反應的(dí)關(guān)鍵，PCR 產物(wù)的特異性取決於引物(wù)與(yǔ)模板(bǎn)DNA互補(bǔ)的(dí)程度。理(lǐ)論上(shàng)，隻(zhī)要知道(dào)任(rèn)何一段(duàn)模(mó)板DNA序(xù)列(liè)， 就(jiù)能按其(qí)設計互(hù)補的寡(guǎ)核苷酸鏈做引(yǐn)物(wù)，利用PCR就可(kě)將模(mó)板(bǎn)DNA在體外(wài)大(dà)量擴增。設計引物(wù)應遵循以下原(yuán)則(zé)：
①引(yǐn)物長度(dù)： 15-30bp，常(cháng)用(yòng)為(wéi)20bp左右。
②引物擴(kuò)增(zēng)跨(kuà)度： 以(yǐ)200-500bp為(wéi)宜，特(tè)定(dìng)條件(jiàn)下可(kě)擴增長(cháng)至(zhì)10kb的片段。
③引(yǐn)物(wù)鹼基：G+C含(hán)量以40-60%為宜，G+C太(tài)少(shǎo)擴(kuò)增(zēng)效(xiào)果不佳，G+C過(guò)多易出(chū)現非(fēi)特異條帶。ATGC隨機(jī)分(fēn)布，避(bì)免(miǎn)5個(gè)以上(shàng)的(dí)嘌(piāo)呤或嘧(mì)啶核苷(gān)酸(suān)的(dí)成串排列。
④避(bì)免引物(wù)內(nèi)部(bù)出現二級結構，避免(miǎn)兩條引物間互補(bǔ)，特別(bié)是(shì)3'端的互補，否(fǒu)則會形成引(yǐn)物二(èr)聚體，產生(shēng)非(fēi)特(tè)異的(dí)擴增(zēng)條帶。
⑤引物(wù)3'端的鹼(jiǎn)基，特別是末(mò)及(jí)倒(dǎo)數第二個(gè)鹼(jiǎn)基，應(yīng)嚴(yán)格要求(qiú)配對(duì)，以(yǐ)避免(miǎn)因(yīn)末(mò)端(duān)鹼基(jī)不(bù)配對(duì)而導(dǎo)致(zhì)PCR失敗(bài)。
⑥引物中(zhōng)有或(huò)能加上合(hé)適(shì)的(dí)酶(méi)切位點(diǎn)， 被(bèi)擴增(zēng)的(dí)靶序(xù)列有(yǒu)適宜(yí)的酶(méi)切位(wèi)點， 這對酶(méi)切(qiē)分析(xī)或分(fēn)子(zǐ)克(kè)隆很有好處。
⑦引(yǐn)物的(dí)特異(yì)性：引(yǐn)物(wù)應(yīng)與核酸序(xù)列(liè)數據(jù)庫(kù)的其(qí)它(tā)序(xù)列無明顯(xiǎn)同(tóng)源性。
引物(wù)量(liáng)：每(měi)條(tiáo)引(yǐn)物的濃(nóng)度0.1～1umol或10～100pmol，以低引物量(liáng)產生所(suǒ)需(xū)要(yào)的結果(guǒ)為好，引物濃度(dù)偏高會引(yǐn)起錯(cuò)配(pèi)和非特異性(xìng)擴增，且可增(zēng)加引物(wù)之間(jiān)形成二聚體(tǐ)的機會(huì)。
 
 實(shí)驗(yàn)注(zhù)意(yì)事(shì)項：
 
1）RT-PCR可(kě)以檢(jiǎn)測組織，細胞(bāo)，血(xiě)液(yè)，細菌(jūn)等很多材(cái)料(liào)，不同(tóng)的(dí)樣本有不同要求(qiú)，實(shí)驗(yàn)前請充(chōng)分溝通確(què)認實驗(yàn)方(fāng)案(àn)和樣(yàng)本情況(kuàng)；
 
2）客(kè)戶盡可能(néng)提(tí)供實(shí)驗的背景(jǐng)信息，物種，基因準確的名(míng)稱(chēng)和ID號；
 
3）客(kè)戶(hù)盡量(liáng)不要(yào)提(tí)供DNA或(huò)RNA樣品。
 
4）樣(yàng)本(běn)保存(cún)於(yú)液(yè)氮或幹冰，也可以保(bǎo)存(cún)於Trizol液(yè)中(zhōng)。
 
實時(shí)熒光定(dìng)量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指在(zài)PCR反(fǎn)應體係中加入熒(yíng)光(guāng)基團，利用(yòng)熒光信號(hào)積累實時監測整個PCR進程，*通過標準曲綫對未知(zhī)模板進行(háng)定量分析(xī)的(dí)方法。實(shí)時(shí)熒光定量(liáng)PCR的(dí)化學原(yuán)理包括(kuò)探針類(lèi)和(hé)非探針類兩類(lèi)，探針類是(shì)利(lì)用(yòng)與靶(bǎ)細胞(bāo)序(xù)列特(tè)異性雜(zá)交的探針來(lái)指(zhǐ)示擴增產物(wù)的增加(jiā)，非探(tàn)針類(lèi)是(shì)利(lì)用熒(yíng)光染料(liào)或者(zhě)特異(yì)性設(shè)計(jì)的(dí)引物來指示擴增的(dí)增(zēng)加(jiā)。運用該技(jì)術(shù)可以對(duì)DNA，RNA樣品(pǐn)進(jìn)行定(dìng)量（包括*定(dìng)量和(hé)相(xiāng)對定(dìng)量(liáng)）和(hé)定性(xìng)分(fēn)析(xī)。
 
主(zhǔ)要(yào)服務：DNA或(huò)RNA的*定(dìng)量(liáng)分(fēn)析(xī)，基(jī)因(yīn)表(biǎo)達差(chà)異分析(xī)，基(jī)因分型。
 
主(zhǔ)要(yào)技術：引物設(shè)計(jì)，RNA提(tí)取(qǔ)，cDNA合成，qPCR。