細(xì)胞(bāo)凍(dòng)存及(jí)復蘇(sū)的基(jī)本原(yuán)則是慢凍快(kuài)融(róng)，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以最大(dà)限度(dù)的保存細(xì)胞活(huó)力(lì)。如(rú)今細(xì)胞(bāo)凍存(cún)多采用甘油(yóu)或(huò)二甲基亞(yà)碸作保護劑(jì)，這兩(liǎng)種物質能提(tí)高細(xì)胞(bāo)膜(mó)對水(shuǐ)的(dí)通透(tòu)性，加上(shàng)緩慢冷凍可使(shǐ)細(xì)胞內的水(shuǐ)分滲(shèn)出(chū)細(xì)胞(bāo)外，減少(shǎo)細胞內(nèi)冰(bīng)晶的形成，從(cóng)而減(jiǎn)少由於冰晶(jīng)形成造成的(dí)細胞(bāo)損(sǔn)傷。復(fù)蘇細胞應采用快速融(róng)化的(dí)方(fāng)法，這樣(yàng)可以(yǐ)保(bǎo)證細(xì)胞(bāo)外結(jié)晶(jīng)在(zài)很(hěn)短的(dí)時(shí)間內即融(róng)化，避(bì)免(miǎn)由(yóu)於緩(huǎn)慢融化(huà)使水分滲入(rù)細胞內形成胞(bāo)內再(zài)結晶(jīng)對(duì)細胞造(zào)成損(sǔn)傷。

一(yī)，細胞復(fù)蘇

將凍(dòng)存細(xì)胞從液氮中(zhōng)取出(chū)後，在37℃水浴鍋(guō)內(nèi)不斷(duàn)搖(yáo)動(dòng)促進(jìn)其融(róng)化。移(yí)人(rén)15ml離(lí)心管中(zhōng)，加入(rù)10ml預(yù)熱的DMEM完(wán)全(quán)培養(yǎng)基，輕(qīng)輕吹匀(yún)，離心(xīn)，2000rpmX2min，棄上(shàng)清液。

加(jiā)入10ml DMEM培(péi)養基清洗(xǐ)，棄(qì)上(shàng)清(qīng)液(yè)。加入(rù)10ml DMEM完全培(péi)養(yǎng)基，輕(qīng)輕吹(chuī)打，接種(zhǒng)於10cm盤(pán)中，在含5%CO2的(dí)細胞培(péi)養箱中培養。

二，細胞傳代

細(xì)胞(bāo)密度達到(dào)80%~90%時．去培(péi)養基(jī)，10ml PBS清洗2次。加入(rù)3ml含(hán)0．25%EDTA的(dí)胰(yí)蛋(dàn)白酶，放(fàng)人細胞培(péi)養(yǎng)箱3min。加人(rén)1ml DMEM完全(quán)培養(yǎng)基終(zhōng)止胰酶消(xiāo)化，轉(zhuǎn)移(yí)至15ml離(lí)心管(guǎn)。

加入10ml PBS清洗(xǐ)細(xì)胞(bāo)培(péi)養盤，轉(zhuǎn)移(yí)至(zhì)15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清(qīng)液。再(zài)加(jiā)入10ml PBS（經高(gāo)壓滅(miè)菌(jūn)，保存於40C），吹匀，吸(xī)取(qǔ)10微(wēi)升進行計(jì)數(shù)，按(àn)照(zhào)1×106/盤接(jiē)種，在(zài)含5%CO2的細胞(bāo)培養箱(xiāng)繼續(xù)培(péi)養。

三(sān)，細(xì)胞凍(dòng)存

細(xì)胞密度達到80%～90%時(shí)，去(qù)培(péi)養(yǎng)基，10ml PBS清(qīng)洗2次。加(jiā)入(rù)3ml含(hán)0.25%EDTA的胰蛋(dàn)白酶(méi)，放(fàng)人細(xì)胞培(péi)養(yǎng)箱3min。加(jiā)入(rù)lmlDMEM完全(quán)培養基終止胰酶(méi)消(xiāo)化(huà)，轉(zhuǎn)移(yí)至15ml離心管(guǎn)。加(jiā)入(rù)10ml PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤，轉移至(zhì)15ml離心管(guǎn)，2000rpmX2min，棄上(shàng)清液(yè)。

加入lml凍存液（90%血(xiě)清(qīng)，10%DMSO），放入凍(dòng)存盒內(nèi)（盒內(nèi)有(yǒu)異(yì)丙(bǐng)醇，以(yǐ)保(bǎo)證溫(wēn)度(dù)降低的(dí)速度(dù)），立即放(fàng)入一80℃冰箱內(nèi)，過夜，第二(èr)天(tiān)放(fàng)入(rù)液(yè)氮中，可(kě)以保(bǎo)存(cún)至(zhì)少(shǎo)兩年，如不(bù)放人液氮(dàn)，可以保存三個(gè)月。

凍存液(yè)的配(pèi)製：70%的完全培養基(jī)+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢(màn)滴加，邊(biān)滴邊(biān)搖(yáo)。