技術服(fú)務(wù)
Western Blotting技(jì)術服務
Western Blotting技術服務
WESTERN BLOT是以電(diàn)泳(yǒng)分離組分(fēn)，將其(qí)從(cóng)凝膠轉移到(dào)一種固(gù)相支(zhī)持體，繼之以(yǐ)針對(duì)特定氨基酸(suān)序(xù)列(liè)的特(tè)異(yì)性抗體(tǐ)作(zuò)為探(tàn)針檢測(cè)目的蛋白的一(yī)種分(fēn)子生物(wù)學技術(shù)。
免(miǎn)疫印(yìn)跡(jì)(immunoblotting)又(yòu)稱(chēng)蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)，它(tā)是(shì)根(gēn)據抗原抗(kàng)體(tǐ)的(dí)特異性結(jié)合檢(jiǎn)測復雜樣品(pǐn)中的(dí)某種(zhǒng)蛋(dàn)白(bái)的方法(fǎ)。該(gāi)法是(shì)在凝膠(jiāo)電泳(yǒng)和(hé)固(gù)相(xiāng)免(miǎn)疫測定技術基礎(chǔ)上(shàng)發(fā)展起(qǐ)來的(dí)一(yī)種新的(dí)免(miǎn)疫生化技(jì)術。由於(yú)免疫印(yìn)跡(jì)具(jù)有SDS-PAGE的高(gāo)分(fēn)辨力和固相免疫測定(dìng)的(dí)高(gāo)特(tè)異性和敏(mǐn)感性，現已(yǐ)成(chéng)為(wéi)蛋白(bái)分(fēn)析的(dí)一種(zhǒng)常(cháng)規技術。免(miǎn)疫印(yìn)跡(jì)常(cháng)用(yòng)於鑒(jiàn)定(dìng)某種(zhǒng)蛋(dàn)白，並(bìng)能對蛋(dàn)白(bái)進(jìn)行(háng)定性(xìng)和(hé)半(bàn)定量分析。
我司為(wéi)您提(tí)供全(quán)套(tào)免疫印跡(immunoblotting)技(jì)術(shù)服務，全部(bù)實(shí)驗(yàn)皆(jiē)使(shǐ)用高質量試劑完成(chéng)
●主要(yào)實驗(yàn)步(bù)驟如(rú)下：
1. 蛋(dàn)白(bái)質抽(chōu)提
a.實驗(yàn)對象為組(zǔ)織樣品，取(qǔ)適(shì)量(liáng)（250~500mg）新鮮(xiān)組織樣(yàng)品或(huò)正確保存的組織樣品，加1ml含蛋白酶(méi)抑(yì)製(zhì)劑的總蛋(dàn)白(bái)抽提試劑（或(huò)核蛋(dàn)白抽(chōu)提試劑），匀漿(jiāng)後抽(chōu)提總蛋(dàn)白（或(huò)核蛋(dàn)白）。
b.實驗(yàn)對象為細(xì)胞樣品，每份樣品(pǐn)取(qǔ)1×106～1×107細胞(bāo)，PBS清洗細胞(bāo)，去(qù)PBS加0.1ml~1ml含蛋白(bái)酶(méi)抑製劑的總蛋(dàn)白抽(chōu)提試劑（或(huò)核蛋白(bái)抽(chōu)提(tí)試(shì)劑）抽提總(zǒng)蛋白（或核蛋(dàn)白）。
2. 蛋(dàn)白質定(dìng)量
按(àn)KCTMBCA蛋白(bái)質定量(liáng)試(shì)劑盒操作說(shuō)明操作，測定樣(yàng)品濃度。
3. 變(biàn)性聚丙烯酰(xiān)胺不(bù)連續凝膠電(diàn)泳(SDS-PAGE)
將(jiāng)準(zhǔn)備(bèi)好(hǎo)的(dí)樣品液(yè)和生物素標(biāo)記(jì)的蛋白質(zhì)分子(zǐ)量(liáng)標(biāo)準分(fēn)別(bié)上(shàng)樣，標準(zhǔn)加(jiā)進第(dì)一個孔(kǒng)中，電泳(yǒng)分(fēn)離蛋(dàn)白。
4. 蛋(dàn)白質(zhì)轉(zhuǎn)移到(dào)硝酸纖維(wéi)膜(mó)或PVDF膜(mó)
按Bio-Rad蛋白轉移裝(zhuāng)置(zhì)說(shuō)明(míng)組(zǔ)裝濾紙凝(níng)膠纖(xiān)維(wéi)素夾層(céng)，30mA恒(héng)流條件下(xià)，4°C轉移過夜。
5. 膜(mó)的封閉(bì)和抗體(tǐ)孵育
a. 膜(mó)在(zài)5％BSA溶(róng)液(yè)中(zhōng)室溫孵育1小時(shí)以封(fēng)閉膜上(shàng)的非(fēi)特(tè)異(yì)結合。
b. 封(fēng)閉(bì)過的膜(mó)加入一級抗體室(shì)溫(wēn)孵育1.5小(xiǎo)時，抗原(yuán)抗體結合。
c. 加(jiā)入(rù)HRP標(biāo)記的(dí)二(èr)級(jí)抗體以(yǐ)結合一級(jí)抗體及HRP標(biāo)記(jì)的(dí)抗(kàng)生物(wù)素抗(kàng)體以結合(hé)分子量標準(zhǔn)，室溫孵(fū)育膜(mó)1小時(shí)。加入HRP標(biāo)記的GAPDH抗體(tǐ)可(kě)同(tóng)時檢測(cè)GAPDH含量。
6. 結(jié)果檢測
化學發(fā)光(guāng)法檢測，膜與(yǔ)化學(xué)發(fā)光(guāng)底(dǐ)物孵(fū)育，經(jīng)X膠片(piàn)曝光(guāng)顯影。圖(tú)片掃(sǎo)描(miáo)保存為電(diàn)腦文件(jiàn)，並(bìng)用ImageJ分析軟(ruǎn)件(jiàn)將圖片上每個(gè)特(tè)異條帶灰度值的數(shù)字化(huà)。
7. 數(shù)據(jù)分析(xī)
目的(dí)蛋(dàn)白(bái)的灰(huī)度值除(chú)以內參GAPDF的灰度(dù)值以校(xiào)正(zhèng)誤(wù)差(chà)，所得(dé)結(jié)果代表某樣(yàng)品(pǐn)的目的(dí)蛋(dàn)白(bái)相(xiāng)對含量。
8. 提(tí)供(gōng)實驗報(bào)告
包(bāo)括詳(xiáng)細(xì)的(dí)實驗(yàn)方法及(jí)免(miǎn)疫印跡實(shí)驗結果的(dí)相關(guān)圖表(biǎo)。
客(kè)戶方需提(tí)供：
1， 第一(yī)抗體(建議(yì)客戶(hù)定購國外公(gōng)司的(dí)一抗(kàng)，以國外(wài)文(wén)獻(xiàn)中應(yīng)用的(dí)相關第(dì)一抗體(tǐ)為佳(jiā)。
如(rú)Cell signaling technology, Cayman Chemical, Santan Cruz, Zymed等(děng)著名抗體公司(sī)。)
2， 預(yù)實驗(yàn)樣本
3， 正式實驗樣(yàng)本
同(tóng)時希(xī)望客戶(hù)能(néng)提供相應的背景材料以利(lì)實驗(yàn)順利(lì)完(wán)成，背景材(cái)料(liào)包括(kuò)：樣本(běn)描述，目的蛋(dàn)白相(xiāng)關資料(liào)，必(bì)要的相關(guān)實驗(yàn)設計(jì)內(nèi)容如(rú)陽(yáng)性(xìng)對照等等。
★ 公(gōng)司(sī)方(fāng)提(tí)供：
1， 預實(shí)驗結(jié)果(guǒ)
2， 正式(shì)實驗(yàn)結果(guǒ)
如客戶(hù)隻(zhī)需(xū)要進行(háng)預(yù)實驗研(yán)究，我方可隻(zhī)代(dài)理(lǐ)預實驗(yàn)業(yè)務(wù)並(bìng)提供(gōng)結果(guǒ)。
★ 實(shí)驗(yàn)周(zhōu)期與(yǔ)費(fèi)用(yòng)：
預(yù)實(shí)驗(yàn)的費用(yòng)以(yǐ)欲檢測(cè)目的蛋白的種(zhǒng)類(lèi)數目(mù)（或(huò)第(dì)一(yī)抗體(tǐ)種類數(shù)目(mù)）計算(suàn)，公(gōng)司將在材料(liào)和實驗經(jīng)費全(quán)部(bù)到位的工作(zuò)日(rì)後15個工作日之(zhī)內提交實(shí)驗(yàn)結(jié)果。正(zhèng)式(shì)實驗(yàn)費用欲(yù)檢測目(mù)的蛋白的(dí)種(zhǒng)類(lèi)數(shù)目(mù)（或(huò)第(dì)一抗體種類數目(mù)）和樣本數(shù)為(wéi)單位(wèi)計算，實(shí)驗周(zhōu)期(qī)為20個(gè)工作日，公司(sī)將(jiāng)在材料和預(yù)付的實(shí)驗(yàn)經費(fèi)全部(bù)到位(wèi)的工(gōng)作日後20個工(gōng)作日(rì)之內提交實驗(yàn)結果(guǒ)。如(rú)客戶(hù)要求在10個(gè)工(gōng)作日之(zhī)內(nèi)完(wán)成，每單位(wèi)樣品費用(yòng)為常(cháng)規周期的兩(liǎng)倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(guǒ)以(yǐ)膠(jiāo)片的(dí)形(xíng)式提(tí)交給(gěi)客(kè)戶，客戶(hù)需在收到實驗結果後(hòu)一周(zhōu)內(nèi)付清所(suǒ)有剩餘(yú)款項(xiàng)。
