細胞(bāo)增殖及(jí)細胞毒(dú)性檢(jiǎn)測(cè)試劑(jì)盒(hé)(WST-1法(fǎ))使用方(fāng)法(fǎ)：

一(yī)
，樣(yàng)品的準備(bèi)：

方(fāng)法一(yī)：LDH釋(shì)放(fàng)檢測(cè)

a.根據細(xì)胞(bāo)的大(dà)小和生長(cháng)速度(dù)將適量細(xì)胞接種(zhǒng)到96孔細胞(bāo)培(péi)養板中(zhōng)，使(shǐ)待檢測時細(xì)胞密度(dù)不超過80-90%滿
。

b.吸去培養液，用PBS液洗(xǐ)滌(dí)一次
。換新(xīn)鮮培(péi)養液(推(tuī)薦(jiàn)使用含(hán)1%血(xiě)清(qīng)的(dí)低血清(qīng)培(péi)養液(yè)或(huò)適當的無血清培(péi)養液)，將(jiāng)各培養孔(kǒng)分成如下幾組(zǔ)：包括(kuò)無細胞的培養液(yè)孔(kǒng)(背景(jǐng)空白對照(zhào)孔)，未經藥(yào)物處理的對(duì)照細胞(bāo)孔(樣(yàng)品(pǐn)對照孔(kǒng))，未經藥(yào)物處(chǔ)理的用(yòng)於(yú)後續(xù)裂解(jiě)的細胞(bāo)孔(樣品(pǐn)最大(dà)酶活性對照(zhào)孔)，以及藥(yào)物處理的細胞(bāo)孔(藥物(wù)處理(lǐ)樣品孔)，並(bìng)做(zuò)好標記(jì)
。按照實驗(yàn)需(xū)要(yào)給(gěi)予(yú)適(shì)當藥(yào)物處(chǔ)理(lǐ)(如(rú)加入(rù)0-10μl左(zuǒ)右(yòu)特(tè)定(dìng)的(dí)藥物(wù)刺激(jī)，可設(shè)置不同濃(nóng)度(dù)，不同處理(lǐ)時(shí)間，對照(zhào)孔(kǒng)中需(xū)加入(rù)適(shì)當的(dí)藥物溶(róng)劑對照)，繼續按(àn)常規(guī)培養
。到預(yù)定(dìng)的(dí)檢(jiǎn)測時(shí)間點(diǎn)前1小時，從細胞培養(yǎng)箱(xiāng)裏(lǐ)取出細胞(bāo)培養板，在“樣品最大(dà)酶活(huó)性對照孔(kǒng)”中加(jiā)入試劑(jì)盒(hé)提供的LDH釋放試(shì)劑，加(jiā)入(rù)量為原有(yǒu)培養液體積的(dí)10%
。加(jiā)入LDH釋放(fàng)試劑後(hòu)，反復(fù)吹打(dǎ)數(shù)次混匀(yún)，然(rán)後繼續在細(xì)胞(bāo)培(péi)養(yǎng)箱(xiāng)中孵育
。

c.到(dào)達預定時間(jiān)後，將(jiāng)細胞培養(yǎng)板用(yòng)多(duō)孔板(bǎn)離(lí)心(xīn)機400g離(lí)心(xīn)5min
。分別取(qǔ)各孔的上清液120μl，加入(rù)到一新(xīn)的96孔板相應(yīng)孔(kǒng)中(zhōng)，隨(suí)即進行樣品測定
。

方法二(èr)：細(xì)胞(bāo)增殖(zhí)及(jí)細(xì)胞毒性(xìng)檢(jiǎn)測(cè)試劑(jì)盒(hé)(WST-1法(fǎ))細胞內(nèi)總LDH的檢(jiǎn)測(cè)

a.細胞(bāo)毒性檢測：根(gēn)據(jù)細胞的大小和(hé)生長速(sù)度將(jiāng)適量細胞接種到(dào)96孔細(xì)胞(bāo)培養孔板(bǎn)中，使待(dài)檢(jiǎn)測(cè)時(shí)細胞密度(dù)不超過80-90%滿
。加(jiā)入不(bù)同藥(yào)物進行(háng)處(chǔ)理，並設(shè)置適當對(duì)照(zhào)
。藥物刺(cì)激完(wán)畢後(hòu)，將(jiāng)細(xì)胞培(péi)養(yǎng)板(bǎn)用多孔(kǒng)板(bǎn)離心機400g離心5min
。盡量(liáng)吸(xī)除上(shàng)清，加入150μl 用PBS稀釋了10倍的試(shì)劑盒提供的LDH釋放試(shì)劑(10體積(jī)PBS中加(jiā)入1體積LDH釋放(fàng)試劑並混匀)，適當搖晃(huǎng)培(péi)養板(bǎn)混(hùn)匀，然(rán)後繼續(xù)在(zài)細胞培養(yǎng)箱中孵育1小時(shí)
。隨後將細胞培養板用(yòng)多孔板離心(xīn)機400g離(lí)心(xīn)5min
。分別取各孔的(dí)上清液(yè)120μl，加入到(dào)一新(xīn)的(dí)96孔板(bǎn)相應孔(kǒng)中(zhōng)，隨即進行樣(yàng)品測定
。

b.細胞(bāo)增殖檢測：根據細胞的大小和生長速度將(jiāng)適量細胞接種(zhǒng)到96孔細(xì)胞培養(yǎng)孔板中，使(shǐ)促(cù)進細胞增(zēng)殖的藥物刺(cì)激(jī)後細胞不(bù)超過(guò)80-90%滿(mǎn)為宜
。使用(yòng)不(bù)同(tóng)的藥(yào)物刺(cì)激細(xì)胞，並設置適(shì)當對(duì)照
。藥物(wù)刺激完(wán)畢後，將細(xì)胞培(péi)養板用多孔板(bǎn)離(lí)心(xīn)機(jī)400g離(lí)心(xīn)5min
。盡量吸(xī)除上(shàng)清(qīng)，加(jiā)入150μl 用PBS稀(xī)釋了(liǎo)10倍(bèi)的試劑盒提(tí)供的(dí)LDH釋放(fàng)試劑(jì)(10體積PBS中(zhōng)加(jiā)入(rù)1體積(jī)LDH釋放試(shì)劑並混匀)，適當(dāng)搖(yáo)晃混(hùn)匀，然(rán)後(hòu)繼(jì)續(xù)在(zài)細(xì)胞(bāo)培養箱(xiāng)中孵(fū)育1小時
。隨(suí)後(hòu)將(jiāng)細(xì)胞(bāo)培(péi)養板(bǎn)用多孔板離心機(jī)400g離心5min
。分別(bié)取各(gè)孔(kǒng)上清(qīng)液120μl，加(jiā)入到一(yī)新(xīn)的(dí)96孔板(bǎn)相應(yīng)孔中，隨即進(jìn)行樣品(pǐn)測定(dìng)
。

  注：LDH釋放檢(jiǎn)測更加(jiā)常(cháng)用一些(xiē)，細胞內總(zǒng)LDH檢測(cè)通(tōng)常(cháng)可(kě)以使用MTT
，WST-1或(huò)CCK-8等(děng)方法(fǎ)替代(dài)
。