裸(luǒ)鼠環(huán)加氧(yǎng)酶(méi)2(COX-2)elisa試劑盒說明書

檢(jiǎn)測(cè)原理

試劑(jì)盒(hé)采(cǎi)用雙(shuāng)抗體一(yī)步夾(jiā)心(xīn)法(fǎ)酶聯(lián)免(miǎn)疫吸(xī)附試(shì)驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包(bāo)被人(rén)鈣衛(wèi)蛋(dàn)白（Calprotectin）捕獲抗體(tǐ)的(dí)包(bāo)被微孔中(zhōng)，依次(cì)加(jiā)入標本，標準品，HRP標(biāo)記的(dí)檢測(cè)抗體(tǐ)，經(jīng)過溫育並徹底洗滌(dí)。用底物(wù)TMB顯色(sè)，TMB在(zài)過氧化物酶的催化下(xià)轉(zhuǎn)化(huà)成藍色(sè)，並在酸的(dí)作用(yòng)下(xià)轉化成最終的(dí)黃色(sè)。顏色(sè)的(dí)深(shēn)淺和樣品中的人(rén)鈣衛蛋白（Calprotectin）呈(chéng)正相關。用酶標(biāo)儀(yí)在(zài)450nm 波長下測定吸光度（OD 值(zhí)），計算樣品濃(nóng)度。

樣品收(shōu)集，處(chǔ)理及保(bǎo)存方法(fǎ)

1.  血清
：使用不含熱原和(hé)內(nèi)毒素的(dí)試管，操作(zuò)過程中避免任何細胞刺激(jī)，收集血液(yè)後(hòu)，3000轉離心10分鐘將血清(qīng)和紅細(xì)胞迅(xùn)速小心(xīn)地(dì)分離。

2.  血漿(jiāng)
：EDTA，檸(níng)檬(méng)酸鹽或肝(gān)素抗凝(níng)。3000轉離心30分(fēn)鐘取(qǔ)上(shàng)清(qīng)。

3.  細胞(bāo)上清液(yè)
：3000轉離心10分(fēn)鐘(zhōng)去(qù)除顆(kē)粒和聚(jù)合(hé)物。

4.  組織(zhī)匀(yún)漿
：將(jiāng)組織加入適(shì)量生理鹽水搗碎(suì)。3000轉離心(xīn)10分鐘取(qǔ)上(shàng)清。

5.  保存(cún)
：如果樣(yàng)本收(shōu)集後不及(jí)時(shí)檢(jiǎn)測(cè)，請(qǐng)按一次用量分(fēn)裝，凍(dòng)存於-20℃，避免(miǎn)反(fǎn)復(fù)凍融(róng)，在(zài)室溫(wēn)下(xià)解凍並確(què)保樣(yàng)品均(jūn)匀(yún)地(dì)充(chōng)分解(jiě)凍(dòng)。

自(zì)備物品(pǐn)

1.     酶(méi)標(biāo)儀（450nm）

2.     高精度加(jiā)樣(yàng)器及槍(qiāng)頭
：0.5-10uL，2-20uL，20-200uL，200-1000uL

3.     37℃恒(héng)溫箱(xiāng)

操(cāo)作(zuò)注(zhù)意事項

1.  試劑盒保(bǎo)存(cún)在2-8℃，使用前室(shì)溫(wēn)平(píng)衡20分鐘。從冰(bīng)箱取(qǔ)出的濃縮洗滌液會有結晶，這屬於正(zhèng)常現(xiàn)象，水浴加熱使(shǐ)結晶完(wán)全溶解(jiě)後(hòu)再使(shǐ)用。

2.  實驗中不用(yòng)的(dí)板條應立(lì)即放回自封(fēng)袋(dài)中，密(mì)封（低(dī)溫幹燥）保存(cún)。

3.  標準(zhǔn)品稀(xī)釋液(yè)即(jí)可視為陰性對(duì)照或者空(kōng)白；預(yù)處(chǔ)理後的(dí)樣本(běn)無需(xū)稀(xī)釋(shì)，直(zhí)接取10μL加(jiā)樣即(jí)可。

4.  嚴格(gé)按(àn)照說(shuō)明書(shū)中標明的時間，加(jiā)液量(liáng)及順序進行溫育(yù)操作。

5.  所有液體(tǐ)組分(fēn)使用(yòng)前(qián)充分搖匀。

試(shì)劑盒組(zǔ)成(chéng)

名稱(chēng) 96孔(kǒng)配置 48孔配(pèi)置 備注(zhù)

微孔酶標板 12孔×8條 12孔×4條 無(wú)

標準(zhǔn)品(pǐn)（120μg/g） 0.6mL 0.6mL 按(àn)說(shuō)明(míng)書進行稀釋(shì)

標準品稀釋液 6mL 3mL 無

樣本(běn)稀釋液 6mL 3mL 無(wú)

檢(jiǎn)測抗(kàng)體(tǐ)-HRP 10mL 5mL 無

20×洗滌(dí)緩衝液 25mL 15mL 按(àn)說(shuō)明(míng)書進行(háng)稀釋(shì)

底物(wù)A 6mL 3mL 無(wú)

底(dǐ)物B 6mL 3mL 無(wú)

終(zhōng)止(zhǐ)液 6mL 3mL 無

封(fēng)板膜 2張 2張 無

說明(míng)書 1份 1份(fèn) 無

自封(fēng)袋(dài) 1個 1個 無

注
：標準(zhǔn)品(pǐn)用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(yè)依次稀釋為(wéi)
：120，60，30，15，7.5，3.75 μg/g

試(shì)劑的(dí)準備(bèi)

20×洗(xǐ)滌(dí)緩衝(chōng)液(yè)的稀釋(shì)
：蒸(zhēng)餾水按1
：20稀釋，即1份的20×洗(xǐ)滌(dí)緩(huǎn)衝(chōng)液加(jiā)19份的蒸餾水。

洗板方法

1.  手工洗(xǐ)板
：甩盡孔內(nèi)液體，每(měi)孔加滿洗滌液(yè)，靜(jìng)置1min後甩盡孔(kǒng)內(nèi)液體，在(zài)吸(xī)水(shuǐ)紙(zhǐ)上(shàng)拍(pāi)幹(gān)，如(rú)此(cǐ)洗板5次。

2.  自動(dòng)洗(xǐ)板(bǎn)機
：每(měi)孔注(zhù)入(rù)洗(xǐ)液350μL，浸(jìn)泡(pào)1min，洗(xǐ)板5次。

操(cāo)作步驟

1.  從室溫(wēn)平(píng)衡(héng)20min後(hòu)的(dí)鋁箔(bó)袋中(zhōng)取出(chū)所(suǒ)需板(bǎn)條，剩餘(yú)板條用自封(fēng)袋(dài)密封放回4℃。

2.  設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品(pǐn)孔(kǒng)和樣本孔，標準品孔各加不(bù)同濃度(dù)的(dí)標準品50μL；

3.  待(dài)測(cè)樣本孔先(xiān)加待測樣本10μL，再加(jiā)樣(yàng)本稀釋液(yè)40μL；

4.  隨後標準品(pǐn)孔和(hé)樣(yàng)本孔中(zhōng)每(měi)孔加(jiā)入(rù)辣根(gēn)過氧(yǎng)化(huà)物酶（HRP）標記的(dí)檢測抗體(tǐ)100μL，用封板膜(mó)封住(zhù)反應孔，37℃水浴(yù)鍋或恒(héng)溫箱(xiāng)溫育60min。

5.  棄去液體，吸水(shuǐ)紙上(shàng)拍幹，每(měi)孔(kǒng)加滿(mǎn)洗(xǐ)滌液，靜置(zhì)1min，甩去洗滌(dí)液(yè)，吸水(shuǐ)紙上拍幹，如此(cǐ)重復洗板(bǎn)5次（也(yě)可(kě)用洗板機(jī)洗板(bǎn)）。

6.  每孔加(jiā)入(rù)底(dǐ)物A，B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入(rù)終(zhōng)止液(yè)50μL，15min內，在(zài)450nm波長處測定各孔的OD值。

結(jié)果判斷(duàn)

繪製標(biāo)準曲綫(xiàn)
：在Excel工作(zuò)表中(zhōng)，以標準品濃度(dù)作(zuò)橫坐標(biāo)，對(duì)應OD值作(zuò)縱(zòng)坐(zuò)標，繪(huì)製(zhì)出標準(zhǔn)品綫(xiàn)性(xìng)回歸曲(qū)綫(xiàn)，按曲綫方程(chéng)計算(suàn)各樣本濃(nóng)度值(zhí)。

試劑盒性(xìng)能(néng)

1.  準(zhǔn)確性
：標(biāo)準品(pǐn)綫(xiàn)性回歸與預(yù)期濃(nóng)度(dù)相關係數R值，大(dà)於等於(yú)0.9900。

2.  靈敏度(dù)
：最低(dī)檢測濃度小於(yú)1.0μg/g。

3.  特(tè)異(yì)性(xìng)
：不(bù)與其(qí)它(tā)可溶性結(jié)構(gòu)類(lèi)似(sì)物交叉反(fǎn)應。

4.  重(zhòng)復(fù)性(xìng)
：板(bǎn)內(nèi)，板間(jiān)變(biàn)異係(xì)數均小於15%。

5.  貯(zhù)藏
：2-8℃，避光防(fáng)潮保(bǎo)存。

6.  有(yǒu)效期
：6個(gè)月

免責(zé)聲(shēng)明(míng)

1.   試(shì)劑盒僅供(gōng)研究使用，不(bù)得用於臨(lín)床(chuáng)實驗(yàn)或(huò)人(rén)體實(shí)驗，否則(zé)所產生的一切後(hòu)果，由(yóu)實(shí)驗者承擔，本公司概(gài)不負責。

2.   嚴(yán)格按(àn)照(zhào)說明(míng)書(shū)操(cāo)作(zuò)，實驗(yàn)者違反說(shuō)明(míng)書操作，後果由實(shí)驗者承擔(dān)。