檢(jiǎn)測(cè)原理(lǐ)
試劑盒(hé)采(cǎi)用雙抗體一步夾心(xīn)法酶聯免(miǎn)疫吸附試驗（ELISA）
。往(wǎng)預先(xiān)包(bāo)被人(rén)鈣(gài)衛蛋白(bái)（Calprotectin）捕獲抗體的(dí)包被(bèi)微孔(kǒng)中，依次加入標(biāo)本(běn)
，標準(zhǔn)品
，HRP標(biāo)記的(dí)檢測(cè)抗體，經過溫(wēn)育並(bìng)徹(chè)底(dǐ)洗滌
。用底物TMB顯色(sè)，TMB在過氧(yǎng)化物酶的(dí)催化(huà)下(xià)轉化成藍色(sè)，並在酸的(dí)作(zuò)用下(xià)轉化成最終(zhōng)的(dí)黃(huáng)色
。顏色的深淺(qiǎn)和樣(yàng)品(pǐn)中的(dí)人鈣衛(wèi)蛋白（Calprotectin）呈正相關
。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(cháng)下測(cè)定(dìng)吸光度（OD 值），計(jì)算樣(yàng)品濃度
。
樣品(pǐn)收集(jí)
，處理(lǐ)及(jí)保存方法
1.  血(xiě)清：使用不含(hán)熱(rè)原(yuán)和內毒素的試(shì)管，操(cāo)作過程中避免(miǎn)任何(hé)細胞刺(cì)激，收集(jí)血液後(hòu)，3000轉離心10分(fēn)鐘(zhōng)將(jiāng)血(xiě)清和紅細(xì)胞(bāo)迅速小心地分離
。
2.  血漿：EDTA
，檸(níng)檬(méng)酸鹽(yán)或肝(gān)素(sù)抗(kàng)凝
。3000轉離心(xīn)30分鐘取(qǔ)上清(qīng)
。
3.  細胞上清液：3000轉離(lí)心(xīn)10分鐘去除顆粒和(hé)聚(jù)合(hé)物
。
4.  組(zǔ)織(zhī)匀(yún)漿(jiāng)：將組(zǔ)織(zhī)加入適量(liáng)生理鹽(yán)水(shuǐ)搗碎
。3000轉離(lí)心(xīn)10分(fēn)鐘取(qǔ)上清(qīng)
。
5.  保存：如果(guǒ)樣本收(shōu)集(jí)後不及時(shí)檢測，請按一(yī)次(cì)用量分裝，凍存於(yú)-20℃，避(bì)免(miǎn)反(fǎn)復(fù)凍融，在室溫下解凍並確(què)保(bǎo)樣品均匀地(dì)充分(fēn)解凍
。
自備(bèi)物品
1.     酶標儀(yí)（450nm）
2.     高精度(dù)加樣器及槍頭：0.5-10uL
，2-20uL
，20-200uL
，200-1000uL
3.     37℃恒(héng)溫箱
操作(zuò)注意(yì)事(shì)項
1.  試劑盒保存在(zài)2-8℃，使(shǐ)用前(qián)室溫(wēn)平(píng)衡(héng)20分(fēn)鐘
。從冰箱(xiāng)取出(chū)的濃(nóng)縮洗(xǐ)滌(dí)液(yè)會有結晶，這屬(shǔ)於正常(cháng)現象，水浴加(jiā)熱(rè)使結晶(jīng)完(wán)全溶解後(hòu)再(zài)使(shǐ)用
。
2.  實驗中不用的板條應立(lì)即(jí)放回自封袋中，密(mì)封（低溫幹燥(zào)）保(bǎo)存
。
3.  標準品稀(xī)釋(shì)液即可視為(wéi)陰(yīn)性對照或(huò)者(zhě)空白(bái)；預處(chǔ)理後的(dí)樣本無需稀釋，直接(jiē)取10μL加(jiā)樣即可(kě)
。
4.  嚴格按照說明書中標明(míng)的時間(jiān)
，加液量(liáng)及順序進(jìn)行(háng)溫育操作
。
5.  所(suǒ)有(yǒu)液體(tǐ)組分使用前(qián)充(chōng)分搖(yáo)匀(yún)
。
試劑(jì)盒(hé)組成(chéng)
名稱 96孔配置(zhì) 48孔配(pèi)置(zhì) 備注
微孔酶標(biāo)板 12孔×8條(tiáo) 12孔(kǒng)×4條 無
標(biāo)準品(pǐn)（120μg/g） 0.6mL 0.6mL 按(àn)說明書進行稀(xī)釋(shì)
標準品稀釋液(yè) 6mL 3mL 無
樣本稀釋(shì)液(yè) 6mL 3mL 無
檢測(cè)抗體-HRP 10mL 5mL 無(wú)
20×洗滌緩(huǎn)衝液 25mL 15mL 按說(shuō)明(míng)書進行稀釋(shì)
底物A 6mL 3mL 無
底物(wù)B 6mL 3mL 無
終止(zhǐ)液 6mL 3mL 無
封板(bǎn)膜(mó) 2張(zhāng) 2張(zhāng) 無
說明書 1份(fèn) 1份(fèn) 無(wú)
自封(fēng)袋(dài) 1個 1個 無
注：標(biāo)準品(pǐn)用(yòng)標(biāo)準品(pǐn)稀(xī)釋液依次稀釋(shì)為：120
，60
，30
，15
，7.5
，3.75 μg/g
試劑的準(zhǔn)備
 20×洗滌緩衝(chōng)液的(dí)稀釋：蒸餾水(shuǐ)按1：20稀釋(shì)，即1份(fèn)的20×洗滌(dí)緩(huǎn)衝(chōng)液加(jiā)19份的蒸餾水
。
洗(xǐ)板(bǎn)方法(fǎ)
1.  手(shǒu)工(gōng)洗(xǐ)板：甩盡(jìn)孔(kǒng)內(nèi)液體，每孔(kǒng)加滿(mǎn)洗滌(dí)液，靜置(zhì)1min後甩盡孔(kǒng)內液體(tǐ)，在(zài)吸水紙上拍(pāi)幹，如(rú)此(cǐ)洗(xǐ)板(bǎn)5次
。
2.  自動洗板機(jī)：每孔注(zhù)入洗液350μL，浸(jìn)泡1min，洗(xǐ)板(bǎn)5次
。
操作步(bù)驟
1.  從室(shì)溫(wēn)平(píng)衡20min後的鋁箔袋中(zhōng)取出所(suǒ)需(xū)板條(tiáo)，剩餘(yú)板條(tiáo)用(yòng)自(zì)封袋密(mì)封放回4℃
。
2.  設置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣(yàng)本孔，標準品孔(kǒng)各加不同(tóng)濃度的(dí)標準品(pǐn)50μL；
3.  待測樣本孔先加待測樣本(běn)10μL，再加樣(yàng)本(běn)稀釋液(yè)40μL；
4.  隨(suí)後標準品(pǐn)孔和(hé)樣(yàng)本孔(kǒng)中(zhōng)每(měi)孔(kǒng)加(jiā)入辣根過(guò)氧化物(wù)酶(méi)（HRP）標記的檢測抗體100μL，用(yòng)封(fēng)板(bǎn)膜(mó)封(fēng)住(zhù)反應孔(kǒng)，37℃水浴鍋或(huò)恒溫(wēn)箱溫(wēn)育(yù)60min
。
5.  棄去液(yè)體，吸(xī)水(shuǐ)紙上拍幹，每(měi)孔加滿洗(xǐ)滌液，靜置1min，甩(shuǎi)去洗滌液，吸(xī)水(shuǐ)紙上拍(pāi)幹(gān)，如(rú)此(cǐ)重復洗(xǐ)板(bǎn)5次(cì)（也可用洗板機洗(xǐ)板）
。
6.  每(měi)孔加入(rù)底(dǐ)物A
，B各(gè)50μL，37℃避(bì)光孵(fū)育15min
。
7.  每(měi)孔加(jiā)入終止液50μL，15min內(nèi)，在(zài)450nm波長處測定各孔的OD值
。
結果判斷
 繪(huì)製標準曲綫(xiàn)：在Excel工作(zuò)表(biǎo)中，以(yǐ)標(biāo)準品濃度作橫坐標，對(duì)應(yīng)OD值作縱坐(zuò)標(biāo)，繪製出(chū)標準品(pǐn)綫(xiàn)性回(huí)歸(guī)曲(qū)綫(xiàn)，按(àn)曲綫方(fāng)程(chéng)計算(suàn)各(gè)樣(yàng)本濃度(dù)值(zhí)
。
試劑盒性(xìng)能(néng)
1.  準(zhǔn)確性：標(biāo)準品(pǐn)綫性回歸與(yǔ)預期濃(nóng)度相關(guān)係(xì)數R值(zhí)，大於(yú)等於0.9900
。
2.  靈敏(mǐn)度：最低(dī)檢(jiǎn)測濃(nóng)度小於1.0μg/g
。
3.  特異性：不(bù)與其它可(kě)溶性結(jié)構類似(sì)物(wù)交(jiāo)叉反應
。
4.  重復(fù)性：板(bǎn)內(nèi)
，板間(jiān)變(biàn)異(yì)係數(shù)均(jūn)小於(yú)15%
。
5.  貯藏：2-8℃，避光防(fáng)潮保(bǎo)存
。
6.  有效(xiào)期(qī)：6個月
免責聲明
1.   試(shì)劑盒僅供研究使(shǐ)用(yòng)，不(bù)得(dé)用(yòng)於臨床實(shí)驗或人體(tǐ)實(shí)驗，否則(zé)所(suǒ)產生的一切(qiē)後果，由實(shí)驗者承(chéng)擔，本公(gōng)司概不(bù)負(fù)責
。
2.   嚴格(gé)按(àn)照說明書操(cāo)作(zuò)，實驗(yàn)者(zhě)違(wéi)反(fǎn)說明(míng)書(shū)操作(zuò)，後果由實驗者承擔(dān)
。