猴(hóu)Ⅳ型膠原(yuán)(Col Ⅳ)elisa試(shì)劑盒(hé)說明書(shū)

試驗(yàn)原理(lǐ)：

TRH試(shì)劑(jì)盒(hé)是固(gù)相夾(jiā)心(xīn)法(fǎ)酶聯(lián)免疫吸(xī)附實驗(yàn)（ELISA）.已(yǐ)知TRH濃度的(dí)標準(zhǔn)品，未知濃度的樣品加入微孔酶標板(bǎn)內進(jìn)行檢(jiǎn)測(cè)。先將(jiāng)TRH和(hé)生(shēng)物素標記的(dí)抗體(tǐ)同時(shí)溫育。洗(xǐ)滌(dí)後，加入親(qīn)和素(sù)標記過的HRP。再經(jīng)過(guò)溫育(yù)和洗(xǐ)滌(dí)，去除未(wèi)結合(hé)的酶結合物，然後加(jiā)入底(dǐ)物A，B，和酶(méi)結(jié)合物同時(shí)作用。產(chǎn)生(shēng)顏(yán)色。顏(yán)色的(dí)深淺(qiǎn)和(hé)樣(yàng)品(pǐn)中TRH的濃(nóng)度呈比例關係。

試劑盒(hé)內容及(jí)其配製(zhì)

試(shì)劑盒成(chéng)份(fèn)（2-8℃保存(cún)） 96孔(kǒng)配置 48孔配(pèi)置(zhì) 配製

96/48人份酶(méi)標板 1塊(kuài)板(bǎn)（96T） 半塊(kuài)板(bǎn)（48T） 即用型

塑(sù)料(liào)膜板蓋(gài) 1塊 半塊 即用(yòng)型

標準品：24ng/ml 1瓶（0.6ml） 1瓶(píng)（0.3ml） 按說明(míng)書進(jìn)行稀稀

空(kōng)白(bái)對照 1瓶（1.0ml） 1瓶(píng)（0.5ml） 即(jí)用(yòng)型

標準品(pǐn)稀釋(shì)緩衝液(yè) 1瓶(píng)（5ml） 1瓶（2.5ml） 即用型

生(shēng)物(wù)素(sù)標記(jì)的抗TRH抗(kàng)體 1瓶（6ml） 1瓶（3.0ml） 即用型

親(qīn)和(hé)鏈酶(méi)素-HRP 1瓶（10ml） 1瓶(píng)（5.0ml） 即用型

洗(xǐ)滌(dí)緩衝液(yè) 1瓶（20ml） 1瓶（10ml） 按(àn)說明書(shū)進行稀釋(shì)

底物(wù)A 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即用型

底(dǐ)物B 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即(jí)用(yòng)型(xíng)

終止(zhǐ)液 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即(jí)用型(xíng)

自備(bèi)材(cái)料(liào)

1． 蒸餾水。

2． 加(jiā)樣器：5ul，10ul，50ul，100ul，200，500ul，1000ul。

3． 振蕩器及磁(cí)力(lì)攪拌器等(děng)。

安(ān)全性(xìng)

1． 避免(miǎn)直接接(jiē)觸終止(zhǐ)液和底(dǐ)物A，B。一(yī)旦接觸(chù)到這些液體，請(qǐng)盡(jìn)快(kuài)用(yòng)水衝洗(xǐ)。

2． 實驗中不要吃喝，抽煙或(huò)使用化(huà)妝品。

3． 不(bù)要(yào)用(yòng)嘴吸取試劑盒(hé)裏的任何成份(fèn)。

操作注意事(shì)項(xiàng)

1． 試(shì)劑應(yīng)按標簽說明(míng)書(shū)儲存(cún)，使用前(qián)恢復(fù)到室溫。稀稀(xī)過(guò)後的標(biāo)準品應丟棄(qì)，不(bù)可(kě)保存。

2． 實(shí)驗(yàn)中(zhōng)不(bù)用(yòng)的板條應(yīng)立即(jí)放回(huí)包裝袋(dài)中(zhōng)，密(mì)封(fēng)保存(cún)，以(yǐ)免變質(zhì)。

3． 不(bù)用(yòng)的(dí)其它試劑(jì)應包裝好或蓋(gài)好。不(bù)同批號的試劑(jì)不(bù)要混用。保質前(qián)使(shǐ)用。

4． 使用一次性(xìng)的(dí)吸頭以免交叉汙(wū)染(rǎn)，吸取(qǔ)終(zhōng)止(zhǐ)液(yè)和底(dǐ)物(wù)A，B液時，避(bì)免使用(yòng)帶金屬部(bù)分(fēn)的加(jiā)樣器(qì)。

5． 使(shǐ)用幹淨(jìng)的(dí)塑料容(róng)器(qì)配(pèi)置(zhì)洗(xǐ)滌液(yè)。使用前充(chōng)分混匀試劑(jì)盒(hé)裏(lǐ)的(dí)各種成份(fèn)及樣(yàng)品(pǐn)。

6． 洗(xǐ)滌酶(méi)標(biāo)板(bǎn)時(shí)應充分拍幹(gān)，不(bù)要(yào)將吸水(shuǐ)紙(zhǐ)直(zhí)接放入(rù)酶(méi)標反(fǎn)應(yīng)孔中(zhōng)吸(xī)水。

7． 底物A應揮發(fā)，避(bì)免長時間打(dǎ)開蓋(gài)子(zǐ)。底物B對光敏感(gǎn)，避免(miǎn)長(cháng)時間暴露於光(guāng)下(xià)。避(bì)免(miǎn)用(yòng)手(shǒu)接(jiē)觸，有毒(dú)。實驗(yàn)完成後應立即讀取OD值。

8． 加入試劑的順序應(yīng)一(yī)致，以保證所有反應(yīng)板孔溫(wēn)育(yù)的(dí)時間(jiān)一樣(yàng)。

9． 按(àn)照說明(míng)書中標明的(dí)時(shí)間(jiān)，加(jiā)液(yè)的(dí)量(liáng)及(jí)順序進(jìn)行溫育操作。

樣品收集(jí)，處(chǔ)理及保(bǎo)存(cún)方法

1， 血清-----操作過(guò)程(chéng)中避免任何細胞刺激。使(shǐ)用(yòng)不含(hán)熱原和內(nèi)毒(dú)素(sù)的(dí)試管。收集血液後，1000×g離(lí)心10分鐘(zhōng)將血清(qīng)和紅(hóng)細(xì)胞迅(xùn)速小心地(dì)分(fēn)離。

2， 血(xiě)漿(jiāng)-----EDTA，檸檬酸鹽，肝(gān)素血漿可(kě)用於檢測。1000×g離心30分鐘去(qù)除顆粒(lì)。

3， 細胞(bāo)上(shàng)清液(yè)---1000×g離心(xīn)10分鐘(zhōng)去除顆(kē)粒和聚(jù)合(hé)物(wù)。

4， 保(bǎo)存------如果樣品不立(lì)即(jí)使(shǐ)用(yòng)，應將其分(fēn)成(chéng)小(xiǎo)部分-70 ℃保存，避(bì)免反復冷(lěng)凍。盡可(kě)能的不要(yào)使用溶(róng)血或(huò)高(gāo)血脂(zhī)血。如果血清(qīng)中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或(huò)更高的溫(wēn)度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解(jiě)凍並確保(bǎo)樣(yàng)品均(jūn)匀(yún)地充(chōng)分(fēn)解凍(dòng)。

試(shì)劑的準(zhǔn)備(bèi)

1． 標準(zhǔn)品：標準(zhǔn)品的係列稀釋應(yīng)在實(shí)驗時準(zhǔn)備(bèi)，不能儲(chǔ)存(cún)。稀釋(shì)前將標準(zhǔn)品振蕩(dàng)混(hùn)匀(yún)。稀(xī)釋比(bǐ)例(lì)按(àn)下表(biǎo)中(zhōng)進行：

24 ng/ml （6號標(biāo)準品） 原(yuán)倍濃度不用(yòng)稀(xī)釋直(zhí)接加入50ul。

12 ng/ml （5號(hào)標準(zhǔn)品） 100ul的原倍標準(zhǔn)品加入(rù)100ul的標準(zhǔn)品稀釋液

6.0 ng/ml （4號(hào)標準品(pǐn)） 100ul的5號(hào)標(biāo)準品(pǐn)加入(rù)100ul的標準品稀釋(shì)液

3.0 ng/ml （3號標(biāo)準品） 100ul的4號標(biāo)準(zhǔn)品(pǐn)加入(rù)100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

1.5 ng/ml （2號標準品(pǐn)） 100ul的3號標準品加(jiā)入100ul的(dí)標(biāo)準品(pǐn)稀(xī)釋液

0.75 ng/ml （1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） 100ul的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的(dí)標(biāo)準(zhǔn)品(pǐn)稀釋(shì)液

0 ng/ml （空白對照） 原(yuán)始(shǐ)濃度不(bù)用稀(xī)釋直(zhí)接加(jiā)入50ul。

2． 洗滌(dí)緩(huǎn)衝(chōng)液（50×）的稀釋：蒸餾(liù)水(shuǐ)50倍稀釋。

操(cāo)作(zuò)步驟(zhòu)

1． 使用前，將(jiāng)所有試劑充分混(hùn)匀。不要使液體產(chǎn)生大(dà)量(liáng)的(dí)泡沫(mò)，以免加(jiā)樣時加(jiā)入大(dà)量(liáng)的氣(qì)泡(pào)，產(chǎn)生(shēng)加樣上的(dí)誤(wù)差(chà)。

2． 根據(jù)待測樣(yàng)品(pǐn)數量(liáng)加(jiā)上(shàng)標準品的數(shù)量決定所需的(dí)板條數(shù)。每(měi)個標(biāo)準品(pǐn)和空(kōng)白孔建(jiàn)議做(zuò)復孔(kǒng)。每個(gè)樣品根(gēn)據自(zì)己(jǐ)的數量來定，能(néng)使用(yòng)復(fù)孔(kǒng)的(dí)盡(jìn)量(liáng)做復孔(kǒng)。

3． 加入(rù)稀(xī)釋(shì)好後的標準品(pǐn)50ul於(yú)反(fǎn)應孔，加入(rù)待(dài)測樣(yàng)品50ul於反應(yīng)孔內。立即加入50ul的(dí)生(shēng)物素標記的(dí)抗(kàng)體(tǐ)。蓋(gài)上膜板，輕(qīng)輕振蕩(dàng)混(hùn)匀(yún)，37℃溫(wēn)育1小時。

4． 甩去孔內(nèi)液體，每孔(kǒng)加滿(mǎn)洗滌液(yè)，振蕩(dàng)30秒，甩(shuǎi)去洗滌(dí)液，用吸水紙拍幹。重復(fù)此(cǐ)操(cāo)作(zuò)3次。如果用洗板(bǎn)機洗滌(dí)，洗(xǐ)滌次(cì)數增加一(yī)次。

5． 每(měi)孔加(jiā)入80ul的(dí)親和鏈(liàn)酶(méi)素-HRP，輕輕振蕩混匀，37℃溫育30分(fēn)鐘(zhōng)。

6． 甩去孔內液(yè)體，每(měi)孔(kǒng)加滿洗滌液，振蕩(dàng)30秒，甩去(qù)洗(xǐ)滌(dí)液，用吸水紙(zhǐ)拍幹。重復(fù)此操(cāo)作3次。如(rú)果用洗(xǐ)板(bǎn)機洗(xǐ)滌，洗滌次數增(zēng)加(jiā)一次。

7． 每孔加(jiā)入底(dǐ)物A，B各50ul，輕輕(qīng)振(zhèn)蕩混(hùn)匀(yún)，37℃溫育10分鐘。避免光(guāng)照(zhào)。

8． 取出酶(méi)標(biāo)板，迅速加入50ul終(zhōng)止(zhǐ)液(yè)，加入終(zhōng)止(zhǐ)液(yè)後(hòu)應(yīng)立(lì)即測定結果(guǒ)。

9． 在(zài)450nm波(bō)長處測(cè)定(dìng)各(gè)孔的(dí)OD值。

建議使用的實驗(yàn)方案

標(biāo)準(zhǔn)品濃度(dù)（ng/ml）

A 24 24 樣品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品 樣品(pǐn) 樣品 樣品 樣(yàng)品(pǐn)

B 12 12 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品 樣品 樣品 樣(yàng)品 樣品 樣品 樣(yàng)品(pǐn)

C 6.0 6.0 樣品(pǐn) 樣品 樣品 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品(pǐn)

D 3.0 3.0 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品 樣(yàng)品 樣品(pǐn)

E 1.5 1.5 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品 樣品 樣品 樣品(pǐn)

F 0.75 0.75 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品 樣(yàng)品 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品(pǐn)

G 0 0 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品

H 樣品 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品

局(jú)限

6號(hào)標(biāo)準品(pǐn)以上的結(jié)果(guǒ)為(wéi)非綫(xiàn)性的，根據(jù)此標準(zhǔn)曲(qū)綫無(wú)法(fǎ)得(dé)到的(dí)結果。

試(shì)劑(jì)盒(hé)性能

1. 靈敏(mǐn)度：zui小的檢(jiǎn)測濃度小(xiǎo)於1號標(biāo)準品(pǐn)。稀(xī)釋度的(dí)綫性(xìng)。樣品綫性回歸(guī)與預期(qī)濃(nóng)度相關(guān)係數R值(zhí)為0.990。

2. 特(tè)異(yì)性(xìng)：不與其(qí)它(tā)細(xì)胞因(yīn)子反(fǎn)應(yīng)。

3. 重復性(xìng)：板(bǎn)內，板間(jiān)變(biàn)異(yì)係數均(jūn)小於10%。

結 果 判 斷 與 分 析(xī)

1，儀(yí)器值(zhí)：於波(bō)長450nm的(dí)酶(méi)標儀上(shàng)讀(dú)取(qǔ)各孔的OD值

2，以吸(xī)光度(dù)OD值為縱坐(zuò)標（Y），相應的TRH標(biāo)準品(pǐn)濃度為橫坐標（X），做得相(xiāng)應的(dí)曲綫，樣品的TRH含量可根(gēn)據其(qí)OD值由標準曲綫換(huàn)算(suàn)出相(xiāng)應(yīng)的(dí)濃(nóng)度(dù)。

3，檢測值範圍：0-24ng/ml

4，敏感(gǎn)度： 0.1 ng/ml