試驗原(yuán)理：

是(shì)固相夾(jiā)心(xīn)法酶聯(lián)免疫吸附(fù)實(shí)驗(yàn)（ELISA）.已知(zhī)待(dài)測物(wù)質濃度的標準品，未知濃(nóng)度的樣(yàng)品加入微(wēi)孔酶標(biāo)板(bǎn)內進行檢(jiǎn)測。先(xiān)將待(dài)測物(wù)質(zhì)和(hé)生物素(sù)標(biāo)記的(dí)抗(kàng)體同(tóng)時溫育。洗(xǐ)滌(dí)後
，加入親(qīn)和(hé)素(sù)標(biāo)記(jì)過的(dí)HRP。再(zài)經過(guò)溫育(yù)和洗滌
，去除(chú)未結合(hé)的(dí)酶結合(hé)物
，然後加(jiā)入(rù)底物A，B
，和(hé)酶(méi)結合(hé)物同時作(zuò)用(yòng)。產(chǎn)生(shēng)顏色。顏(yán)色(sè)的(dí)深淺和樣品中待測物(wù)質的(dí)濃度呈比(bǐ)例關(guān)係(xì)。
分析類(lèi)型：夾(jiā)心(xīn)ELISA

樣本(běn)類型(xíng)：血清，血漿，組(zǔ)織(zhī)，尿(niào)液(yè)，及相關液體(tǐ)等樣本(běn)

產(chǎn)品型式(shì)：48/96孔(kǒng)板(bǎn)
，可拆(chāi)

貯存(cún)方法：試劑(jì)盒未拆開(kāi)
，4℃保(bǎo)存。已(yǐ)拆(chāi)開
，標(biāo)準(zhǔn)品-20℃保存(cún)
，其它(tā)4℃保存。

運(yùn)輸(shū)條件：4℃

樣(yàng)本(běn)體積：50μl
自備材(cái)料

1）蒸(zhēng)餾水(shuǐ)。

2）酶標(biāo)儀(yí)(450nm）

3）高精(jīng)度(dù)加樣(yàng)及(jí)槍頭：0.5-10uL，2-20uL，20-200uL，200-1000uL

4）振蕩器及磁力(lì)攪拌器(qì)等。5）37℃恒(héng)溫箱。

 
安全性(xìng)

1）避(bì)免直接(jiē)接觸終止液和(hé)底物(wù)A，B。一旦接觸到這些(xiē)液(yè)體
，請(qǐng)盡(jìn)快(kuài)用水衝洗。

2）實驗(yàn)中(zhōng)不(bù)要(yào)吃喝，抽煙或(huò)使(shǐ)用化妝品。

3）不要用嘴吸(xī)取試(shì)劑盒(hé)裏的(dí)任何成(chéng)份(fèn)。


樣品收集，處理及保存方法

1）血(xiě)清－－－－-操作過程(chéng)中避免(miǎn)任(rèn)何(hé)細(xì)胞刺(cì)激。使用(yòng)不(bù)含熱(rè)原(yuán)和(hé)內毒(dú)素(sù)的(dí)試管。收集(jí)血(xiě)液後(hòu)
，1000×g離心(xīn)10分(fēn)鐘將(jiāng)血(xiě)清和(hé)紅(hóng)細胞迅速小(xiǎo)心地(dì)分離(lí)。

2）血漿(jiāng)－－－－-EDTA，檸檬(méng)酸鹽(yán)，肝素血(xiě)漿可(kě)用(yòng)於(yú)檢測。1000×g離(lí)心30分(fēn)鐘(zhōng)去除顆粒。

3）細胞上(shàng)清液(yè)－－-1000×g離心(xīn)10分(fēn)鐘去除(chú)顆(kē)粒和聚合(hé)物。

4）組織匀漿－－－－-將組(zǔ)織加入適(shì)量生(shēng)理鹽水搗碎。1000×g離(lí)心(xīn)10分鐘(zhōng)
，取上清液(yè)

5）保存(cún)－－－－－－如(rú)果樣(yàng)品(pǐn)不(bù)立(lì)即使用(yòng)
，應將其分(fēn)成小(xiǎo)部分-70 ℃保(bǎo)存
，避免(miǎn)反(fǎn)復冷(lěng)凍。盡可(kě)能(néng)的不(bù)要使用溶血或高血脂(zhī)血。如果血(xiě)清(qīng)中大量(liáng)顆(kē)粒(lì)
，檢(jiǎn)測前先離心或過濾。不要在(zài)37℃或更高(gāo)的(dí)溫度加(jiā)熱解(jiě)凍(dòng)。應(yīng)在(zài)室溫下(xià)解(jiě)凍(dòng)並確保(bǎo)樣品均匀地充分解凍(dòng)。

 
試(shì)劑(jì)的(dí)準(zhǔn)備

1）標準品：標準品的係(xì)列(liè)稀釋應在實(shí)驗(yàn)時準備(bèi)
，不(bù)能儲(chǔ)存。稀釋前將標準(zhǔn)品(pǐn)振(zhèn)蕩混匀。

2）洗滌緩(huǎn)衝(chōng)液（50×）的(dí)稀釋：蒸餾(liù)水50倍稀(xī)釋(shì)。

 
操(cāo)作步(bù)驟

1）使用前(qián)
，將所(suǒ)有試(shì)劑充分(fēn)混匀(yún)。不(bù)要(yào)使(shǐ)液(yè)體產生大(dà)量的(dí)泡(pào)沫(mò)
，以(yǐ)免(miǎn)加樣(yàng)時加入(rù)大量的氣泡(pào)
，產生加樣上的(dí)誤差(chà)。

2）根據待(dài)測(cè)樣(yàng)品數量(liáng)加(jiā)上(shàng)標準品的數量決(jué)定所需(xū)的(dí)板(bǎn)條(tiáo)數(shù)。每個標準(zhǔn)品(pǐn)和空(kōng)白孔建議做復孔(kǒng)。每(měi)個(gè)樣品根據(jù)自己(jǐ)的數量(liáng)來定
，能(néng)使用復孔(kǒng)的盡量做復孔。標本(běn)用(yòng)標(biāo)本(běn)稀釋液(yè)1：1稀(xī)釋後(hòu)加入50ul於反應(yīng)孔(kǒng)內(nèi)。

3）加(jiā)入(rù)稀釋好後的(dí)標準品50ul於(yú)反(fǎn)應孔，加入(rù)待測樣(yàng)品(pǐn)50ul於反(fǎn)應(yīng)孔(kǒng)內(nèi)。立即加入(rù)50ul的生物素(sù)標記的(dí)抗體(tǐ)。蓋(gài)上膜板(bǎn)
，輕輕振蕩混匀
，37℃溫育1小(xiǎo)時。

4）甩去孔(kǒng)內(nèi)液(yè)體(tǐ)
，每孔加滿洗滌液(yè)
，振(zhèn)蕩(dàng)30秒
，甩去洗(xǐ)滌液(yè)
，用吸水紙(zhǐ)拍幹。重(zhòng)復此操作3次。如(rú)果用(yòng)洗板(bǎn)機洗滌(dí)
，洗(xǐ)滌次數增(zēng)加(jiā)一(yī)次。

5）每(měi)孔加(jiā)入80ul的(dí)親和鏈(liàn)酶素-HRP
，輕輕(qīng)振蕩(dàng)混匀
，37℃溫育30分(fēn)鐘(zhōng)。

6）甩(shuǎi)去(qù)孔(kǒng)內(nèi)液體
，每孔(kǒng)加(jiā)滿洗(xǐ)滌液
，振(zhèn)蕩(dàng)30秒
，甩去(qù)洗滌液
，用(yòng)吸(xī)水(shuǐ)紙拍幹。重(zhòng)復此(cǐ)操(cāo)作3次。如(rú)果用(yòng)洗(xǐ)板機(jī)洗(xǐ)滌
，洗(xǐ)滌(dí)次數增加(jiā)一(yī)次。

7）每孔加(jiā)入(rù)底(dǐ)物A，B各50ul
，輕輕(qīng)振蕩混(hùn)匀
，37℃溫(wēn)育10分鐘。避(bì)免(miǎn)光(guāng)照。

8）取出酶標板
，迅速加入50ul終(zhōng)止(zhǐ)液
，加入終止(zhǐ)液後應立即(jí)測(cè)定結果。

9）在450nm波長(cháng)處測定(dìng)各(gè)孔(kǒng)的OD值。

 

局限(xiàn)

6號標(biāo)準品以上的(dí)結果(guǒ)為非綫性的
，根(gēn)據(jù)此(cǐ)標(biāo)準(zhǔn)曲綫無(wú)法得(dé)到精確(què)的結果。

 
性(xìng)能

1. 靈(líng)敏度：最小(xiǎo)的檢測濃度(dù)小於1號標(biāo)準品。稀(xī)釋度的綫性。樣(yàng)品綫性(xìng)回歸(guī)與(yǔ)預(yù)期濃度相關係數R值(zhí)為(wéi)0.990。

2. 特異性：不(bù)與(yǔ)其它細胞(bāo)因(yīn)子反(fǎn)應。

3. 重復(fù)性：板內(nèi)，板間變(biàn)異係(xì)數均(jūn)小於10%。

 

結果判斷(duàn)與分析(xī)

1，儀器值(zhí)：於波長(cháng)450nm的酶(méi)標(biāo)儀上讀取(qǔ)各孔的(dí)OD值

2，以吸光度OD值(zhí)為縱(zòng)坐(zuò)標(biāo)（Y）
，相應的(dí)待測物質標準品濃(nóng)度為(wéi)橫(héng)坐標（X）
，做(zuò)得相(xiāng)應的曲(qū)綫
，樣品的(dí)待測物(wù)質含量(liáng)可(kě)根據其(qí)OD值(zhí)由標準(zhǔn)曲綫換(huàn)算(suàn)出相(xiāng)應的濃度。

 
實(shí)驗原理(lǐ): 用純化的抗(kàng)體包被(bèi)微(wēi)孔(kǒng)板
，製成固相(xiāng)載(zǎi)體
，往(wǎng)包被抗(kàng)體的微(wēi)孔中依次加入標本(běn)或(huò)者(zhě)標準品，生(shēng)物(wù)素化(huà)的抗體，HRP-標記的親和(hé)素
，經過徹(chè)底(dǐ)洗滌後(hòu)用底(dǐ)物(wù)顯色(sè)。底物(wù)在過氧化(huà)物酶的催化下(xià)轉(zhuǎn)化成(chéng)藍色
， 並在酸的作(zuò)用下(xià)轉(zhuǎn)化成最終的(dí)黃色。 顏色(sè)的(dí)深(shēn)淺(qiǎn)和樣(yàng)品(pǐn)中的(dí)目(mù)標蛋(dàn)白呈正相關。用酶標(biāo)儀在(zài)（450nm）波長下測(cè)定(dìng)測定OD值（吸光度）
，計算(suàn)樣品濃(nóng)度。