灸(jiǔ)甘(gān)草LAMP鑒定試劑盒(hé)使用(yòng)方(fāng)法(fǎ)
：
一(yī)，樣(yàng)品(pǐn)采集
：
1，食(shí)品樣品
：樣(yàng)品(pǐn)的(dí)采集(jí)與預培養按(àn)照樣品的采集(jí)與(yǔ)預(yù)培養(yǎng)按照(zhào)《食(shí)品衛生微生物學檢驗(yàn)阪(bǎn)崎腸杆(gān)菌(jūn)檢驗(yàn)要求(qiú)進行。
2，血液樣品
：用(yòng)無菌(jūn)注射器(qì)抽取受(shòu)檢者(zhě)靜脈(mài)血2mL
，注入無(wú)菌EDTA2Na(或(huò)檸(níng)檬酸(suān)鈉(nà))抗凝管(guǎn)
，立即混(hùn)匀。
3，糞(fèn)便(biàn)樣品
：取(qǔ)糞便置於滅(miè)菌的收集管中送檢(jiǎn)。
4，病灶部(bù)位樣品
：取(qǔ)發病部(bù)位(wèi)新(xīn)鮮滲(shèn)出物，粘液膿(nóng)血(xiě)送(sòng)檢。
一(yī)，稀釋(shì) PCR 陽(yáng)性對(duì)照（以 10E2-10E7 拷(kǎo)貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀(xī)釋(shì)度(dù)為例）
1. 注意
：由(yóu)於(yú)標(biāo)準(zhǔn)品濃度(dù)非常(cháng)高(gāo)
，因此(cǐ)下(xià)列稀釋操(cāo)作(zuò)一定要(yào)在(zài)獨(dú)立的區域進行(háng)
，千(qiān)萬不能汙(wū)染樣(yàng)品或(huò)本(běn)試劑盒的(dí)其他成(chéng)分）。為增(zēng)加產品(pǐn)穩(wěn)定(dìng)性和(hé)避(bì)免(miǎn)擴(kuò)散傳染性(xìng)病原
，本(běn)產(chǎn)品不(bù)提(tí)供活(huó)體樣(yàng)品(pǐn)做(zuò)陽性對照(zhào)
，隻提供可以直(zhí)接使用的 DNA段作為(wéi)陽性(xìng)對照。
2. 標記(jì) 6 個(gè)離(lí)心(xīn)管
，分(fēn)別為 7
，6
，5
，4
，3
，2。
3. 用帶芯槍頭(tóu)分別加入 45 μL 熒光(guāng) PCR 模板稀釋(shì)液(yè)（用(yòng)帶芯槍(qiāng)頭(tóu)
，下同）。
4. 在 7 號管中加(jiā)入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的(dí)陽(yáng)性(xìng)對照(zhào)
，充(chōng)分震(zhèn)蕩 1 分鐘
，得1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放(fàng)冰上(shàng)待用。
5. 換槍頭(tóu)
，在 6 號管中(zhōng)加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性(xìng)對照(zhào)(上步稀釋(shì)所(suǒ)得(dé))
，充(chōng)分(fēn)震蕩 1 分鐘
，得 1×10E6 拷貝(bèi)/μL 的陽性(xìng)對照(zhào)。放(fàng)冰上(shàng)待用(yòng)。
6. 換(huàn)槍頭
，在 5 號(hào)管中(zhōng)加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(zhào)到(dào) 5 號(hào)管(guǎn)中
，充(chōng)分(fēn)震(zhèn)蕩 1 分(fēn)鐘
，得 1×10E5 拷貝(bèi)/μL 的陽性對照(zhào)。放冰上待(dài)用。
7. 重復上(shàng)麵(miàn)的操(cāo)作直到(dào)得(dé)到 6 個稀釋度的(dí)陽性對照。放冰上待用。
注
：上述(shù)樣品建(jiàn)議經(jīng)過增(zēng)菌(jūn)後
，收(shōu)集培養(yǎng)物(wù)用(yòng)於(yú)檢(jiǎn)測。 
二(èr)，DNA提取
：
可采用(yòng)PCR試(shì)劑(jì)盒配備(bèi)的DNA抽提(tí)液(yè)
，按以下說明(míng)進(jìn)行DNA核(hé)酸的(dí)粗(cū)提。也可采(cǎi)購上海(hǎi)澤葉(yè)生(shēng)物科(kē)技有(yǒu)限公(gōng)司生產(chǎn)的DNA提取試劑(jì)盒(hé)(過柱法(fǎ)-熒光配套)或(huò)其他合適(shì)的商業(yè)化(huà)產品
，並(bìng)按(àn)照相(xiāng)應試(shì)劑盒(hé)說(shuō)明進行(háng)操(cāo)作。
1，液(yè)體(tǐ)培養物
：取(qǔ)液體(tǐ)培養物100μL加(jiā)到1.5mL無菌(jūn)離心管(guǎn)中
，8000rpm離心3min
，盡(jìn)量(liáng)吸棄上清
，加(jiā)入50μL DNA抽提液充分混匀
，100℃恒(héng)溫(wēn)10min
，13000rpm離(lí)心3min
，取上清5μL進(jìn)行PCR反(fǎn)應(yīng)。
2，固體培養(yǎng)物(wù)
：挑(tiāo)取單(dān)克(kè)隆(lóng)菌(jūn)落與50μL DNA抽(chōu)提(tí)液充(chōng)分混匀
，100℃恒溫(wēn)10min
，13000rpm離(lí)心(xīn)3min
，取上(shàng)清5μL進行(háng)PCR反應。
3，糞便樣品
：挑(tiāo)取米粒大(dà)小(xiǎo)糞便(biàn)於(yú)滅(miè)菌(jūn)離心(xīn)管中
，加入(rù)0.5mL生理鹽(yán)水
，振(zhèn)蕩(dàng)混(hùn)匀
，13000rpm離(lí)心3分(fēn)鐘
，棄(qì)上清
，沉(chén)澱(diàn)中(zhōng)加入(rù)50μL DNA抽(chōu)提(tí)液充分混(hùn)匀(yún)
，100℃恒溫10min
，13000rpm離心(xīn)3min取上(shàng)清5μL進行PCR反應(yīng)。
4，其(qí)他(tā)液(yè)體標本
：取(qǔ)標本2-3mL
，13000rpm離(lí)心3min
，棄上清(qīng)
，沉(chén)澱中加入50μL DNA抽(chōu)提(tí)液(yè)充分混(hùn)匀
，100℃恒溫(wēn)10min
，13000rpm離(lí)心3min取(qǔ)上清5μL進(jìn)行PCR反應(yīng)。
注(zhù)
：陽(yáng)性對照(zhào)和陰性(xìng)對(duì)照(zhào)為已經抽提好的核酸(無(wú)需(xū)提取)
，直接(jiē)取(qǔ)5μL加入(rù)到反應(yīng)體(tǐ)係(xì)中即(jí)可。由於陽性(xìng)對照濃度較(jiào)高
，建(jiàn)議在樣(yàng)品製(zhì)備(bèi)區域(yù)加入陽性(xìng)對照(zhào)。