檢(jiǎn)測(cè)原理(lǐ)
試劑(jì)盒采用雙抗體(tǐ)一(yī)步夾心法(fǎ)酶聯(lián)免(miǎn)疫吸(xī)附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先(xiān)包被(bèi)人(rén)鈣衛(wèi)蛋(dàn)白（Calprotectin）捕(bǔ)獲抗(kàng)體(tǐ)的(dí)包(bāo)被(bèi)微(wēi)孔中，依次加入標(biāo)本，標準品，HRP標(biāo)記的(dí)檢(jiǎn)測(cè)抗體，經過溫(wēn)育並徹(chè)底(dǐ)洗(xǐ)滌。用(yòng)底物(wù)TMB顯色(sè)，TMB在過氧化(huà)物酶的催化(huà)下轉化(huà)成藍色，並在(zài)酸的作用下轉(zhuǎn)化(huà)成(chéng)最(zuì)終(zhōng)的(dí)黃(huáng)色(sè)。顏(yán)色的深(shēn)淺(qiǎn)和樣品中的人鈣(gài)衛(wèi)蛋白(bái)（Calprotectin）呈(chéng)正相(xiāng)關。用(yòng)酶(méi)標儀(yí)在450nm 波長下測定(dìng)吸光度(dù)（OD 值），計(jì)算(suàn)樣(yàng)品(pǐn)濃(nóng)度。
樣品收集，處理及保存(cún)方法(fǎ)
1.  血清：使用不含熱原(yuán)和(hé)內毒素的(dí)試管，操(cāo)作過程中避免(miǎn)任何(hé)細胞刺(cì)激(jī)，收(shōu)集(jí)血(xiě)液後，3000轉離(lí)心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小(xiǎo)心(xīn)地(dì)分離。
2.  血漿：EDTA，檸檬(méng)酸(suān)鹽或肝(gān)素(sù)抗(kàng)凝。3000轉(zhuǎn)離心30分(fēn)鐘(zhōng)取上清。
3.  細胞上(shàng)清液：3000轉離(lí)心10分鐘去除顆粒(lì)和(hé)聚(jù)合(hé)物。
4.  組織匀漿(jiāng)：將組(zǔ)織加入適量(liáng)生理鹽水搗(dǎo)碎。3000轉離心(xīn)10分鐘取(qǔ)上(shàng)清(qīng)。
5.  保存：如果(guǒ)樣本(běn)收集後(hòu)不及(jí)時檢測(cè)，請按(àn)一次用量(liáng)分裝，凍存於-20℃，避(bì)免反(fǎn)復凍融(róng)，在室(shì)溫下解凍並(bìng)確保(bǎo)樣(yàng)品均(jūn)匀地(dì)充(chōng)分(fēn)解(jiě)凍。
自備物品(pǐn)
1.     酶標(biāo)儀（450nm）
2.     高(gāo)精度加(jiā)樣器及槍(qiāng)頭(tóu)：0.5-10uL，2-20uL，20-200uL，200-1000uL
3.     37℃恒溫箱(xiāng)
操作(zuò)注意事項
1.  試(shì)劑盒(hé)保(bǎo)存(cún)在(zài)2-8℃，使用前室溫平(píng)衡(héng)20分鐘(zhōng)。從冰箱取出(chū)的濃縮洗滌液會有結晶，這(zhè)屬(shǔ)於正常現(xiàn)象，水(shuǐ)浴加(jiā)熱使結晶(jīng)完全溶解(jiě)後再(zài)使用(yòng)。
2.  實(shí)驗中(zhōng)不(bù)用(yòng)的板(bǎn)條應立(lì)即放(fàng)回自封(fēng)袋中(zhōng)，密封(fēng)（低溫幹燥）保(bǎo)存(cún)。
3.  標準(zhǔn)品(pǐn)稀釋液(yè)即(jí)可視為陰(yīn)性對(duì)照(zhào)或者空(kōng)白；預處(chǔ)理(lǐ)後(hòu)的(dí)樣本無需(xū)稀(xī)釋(shì)，直(zhí)接取(qǔ)10μL加樣即可。
4.  嚴格按照(zhào)說明書中標明的(dí)時(shí)間，加(jiā)液量及順(shùn)序進行溫(wēn)育操(cāo)作(zuò)。
5.  所有(yǒu)液體組(zǔ)分使(shǐ)用前(qián)充分搖匀(yún)。
試(shì)劑盒(hé)組成(chéng)
名稱(chēng) 96孔(kǒng)配置 48孔(kǒng)配置 備(bèi)注
微(wēi)孔酶(méi)標板 12孔×8條(tiáo) 12孔×4條(tiáo) 無(wú)
標準(zhǔn)品(pǐn)（120μg/g） 0.6mL 0.6mL 按說(shuō)明(míng)書(shū)進(jìn)行稀釋(shì)
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 6mL 3mL 無
樣(yàng)本(běn)稀(xī)釋(shì)液(yè) 6mL 3mL 無(wú)
檢測(cè)抗體-HRP 10mL 5mL 無(wú)
20×洗滌緩衝液 25mL 15mL 按說明(míng)書(shū)進行稀釋
底(dǐ)物(wù)A 6mL 3mL 無
底(dǐ)物B 6mL 3mL 無
終止液(yè) 6mL 3mL 無(wú)
封(fēng)板膜(mó) 2張(zhāng) 2張(zhāng) 無
說明書 1份 1份(fèn) 無
自封袋 1個 1個 無
注：標(biāo)準品用(yòng)標準品(pǐn)稀釋液依次(cì)稀釋(shì)為：120，60，30，15，7.5，3.75 μg/g
試劑(jì)的準(zhǔn)備
 20×洗(xǐ)滌緩衝液的(dí)稀(xī)釋(shì)：蒸(zhēng)餾(liù)水(shuǐ)按1：20稀(xī)釋(shì)，即(jí)1份(fèn)的(dí)20×洗(xǐ)滌緩衝液加(jiā)19份(fèn)的(dí)蒸餾水。
洗(xǐ)板(bǎn)方法
1.  手(shǒu)工洗板(bǎn)：甩(shuǎi)盡(jìn)孔(kǒng)內液體(tǐ)，每孔加滿洗滌(dí)液(yè)，靜置1min後甩(shuǎi)盡(jìn)孔內液(yè)體，在吸(xī)水紙上拍幹，如此(cǐ)洗板(bǎn)5次(cì)。
2.  自動洗板(bǎn)機：每孔注入洗(xǐ)液350μL，浸泡(pào)1min，洗板(bǎn)5次。
操(cāo)作步(bù)驟
1.  從室(shì)溫平(píng)衡20min後的鋁箔袋中(zhōng)取出(chū)所需板條，剩(shèng)餘(yú)板(bǎn)條(tiáo)用自封袋(dài)密封(fēng)放回(huí)4℃。
2.  設置(zhì)標準(zhǔn)品孔(kǒng)和樣(yàng)本孔，標準品孔(kǒng)各加(jiā)不(bù)同(tóng)濃度的標準(zhǔn)品50μL；
3.  待(dài)測(cè)樣(yàng)本(běn)孔先加待(dài)測(cè)樣(yàng)本(běn)10μL，再(zài)加樣(yàng)本稀(xī)釋(shì)液(yè)40μL；
4.  隨後標(biāo)準品(pǐn)孔和(hé)樣本孔中(zhōng)每(měi)孔加(jiā)入(rù)辣(là)根過氧化物(wù)酶（HRP）標(biāo)記的檢(jiǎn)測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴(yù)鍋或恒溫箱溫(wēn)育60min。
5.  棄去液體，吸水(shuǐ)紙上拍(pāi)幹，每孔(kǒng)加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗(xǐ)滌(dí)液(yè)，吸(xī)水(shuǐ)紙(zhǐ)上(shàng)拍(pāi)幹(gān)，如此重復(fù)洗板(bǎn)5次（也(yě)可用洗板機洗板(bǎn)）。
6.  每孔(kǒng)加入底(dǐ)物A，B各50μL，37℃避光孵育(yù)15min。
7.  每孔加(jiā)入終止(zhǐ)液(yè)50μL，15min內，在(zài)450nm波長(cháng)處測(cè)定(dìng)各(gè)孔的(dí)OD值。
結果判(pàn)斷
 繪(huì)製(zhì)標準曲綫(xiàn)：在(zài)Excel工作表(biǎo)中，以標準品濃度作(zuò)橫(héng)坐(zuò)標，對(duì)應(yīng)OD值(zhí)作縱坐標，繪製出(chū)標(biāo)準品(pǐn)綫性(xìng)回歸曲綫，按(àn)曲綫(xiàn)方程計(jì)算各(gè)樣本濃(nóng)度值。
試劑盒性能(néng)
1.  準確性(xìng)：標準品綫性(xìng)回(huí)歸與預(yù)期濃度相關(guān)係(xì)數R值，大(dà)於(yú)等於0.9900。
2.  靈敏度：最(zuì)低檢測濃度(dù)小(xiǎo)於(yú)1.0μg/g。
3.  特(tè)異(yì)性：不與其它可溶(róng)性結構(gòu)類似(sì)物交(jiāo)叉(chā)反(fǎn)應(yīng)。
4.  重(zhòng)復性：板(bǎn)內，板(bǎn)間(jiān)變異係數均(jūn)小於(yú)15%。
5.  貯藏：2-8℃，避光防潮(cháo)保(bǎo)存(cún)。
6.  有效(xiào)期：6個(gè)月(yuè)
免(miǎn)責聲明(míng)
1.   試劑盒(hé)僅(jǐn)供研究(jiū)使用，不得(dé)用於臨床(chuáng)實(shí)驗或(huò)人體(tǐ)實驗，否(fǒu)則(zé)所(suǒ)產生的一(yī)切(qiē)後果，由實驗者承擔(dān)，本公(gōng)司(sī)概不負(fù)責。
2.   嚴(yán)格(gé)按(àn)照說明(míng)書(shū)操作(zuò)，實(shí)驗者(zhě)違反說明(míng)書操(cāo)作，後果由實驗者(zhě)承(chéng)擔。