兔組織(zhī)因子途徑抑製(zhì)物(wù)(TFPI)elisa檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書

試驗(yàn)原理(lǐ)：

TRH試(shì)劑盒(hé)是固相夾心法(fǎ)酶聯免疫(yì)吸(xī)附實驗（ELISA）.已(yǐ)知TRH濃度(dù)的(dí)標(biāo)準(zhǔn)品(pǐn)
，未知(zhī)濃度的樣品(pǐn)加(jiā)入微(wēi)孔酶標(biāo)板內進行(háng)檢(jiǎn)測。先將TRH和生物素(sù)標記(jì)的抗體同時溫(wēn)育。洗滌後
，加入親和素(sù)標(biāo)記過的HRP。再經過溫育和洗(xǐ)滌(dí)
，去(qù)除(chú)未結(jié)合的酶(méi)結合(hé)物
，然後加入底(dǐ)物A
，B
，和酶(méi)結合物同時作(zuò)用(yòng)。產(chǎn)生顏(yán)色。顏色的(dí)深淺和(hé)樣品中TRH的(dí)濃度(dù)呈(chéng)比例關係。

試劑(jì)盒內容(róng)及其(qí)配製(zhì)

試(shì)劑盒成(chéng)份(fèn)（2-8℃保存） 96孔配置 48孔配置(zhì) 配(pèi)製

96/48人份酶(méi)標板(bǎn) 1塊板（96T） 半塊(kuài)板（48T） 即用型

塑(sù)料(liào)膜(mó)板(bǎn)蓋(gài) 1塊 半塊 即(jí)用型

標(biāo)準品(pǐn)：24ng/ml 1瓶（0.6ml） 1瓶（0.3ml） 按說明書(shū)進行稀稀

空白(bái)對照(zhào) 1瓶(píng)（1.0ml） 1瓶（0.5ml） 即用型

標準(zhǔn)品稀(xī)釋緩衝(chōng)液(yè) 1瓶(píng)（5ml） 1瓶（2.5ml） 即(jí)用(yòng)型(xíng)

生物素標(biāo)記的抗(kàng)TRH抗體 1瓶(píng)（6ml） 1瓶（3.0ml） 即(jí)用(yòng)型(xíng)

親和(hé)鏈酶(méi)素-HRP 1瓶(píng)（10ml） 1瓶（5.0ml） 即用(yòng)型(xíng)

洗滌緩衝液 1瓶(píng)（20ml） 1瓶（10ml） 按(àn)說(shuō)明書(shū)進行(háng)稀釋

底(dǐ)物(wù)A 1瓶(píng)（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即(jí)用型

底物B 1瓶（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即(jí)用(yòng)型(xíng)

終(zhōng)止液 1瓶(píng)（6.0ml） 1瓶（3.0ml） 即(jí)用型

自備材(cái)料

1． 蒸餾水。

2． 加樣器：5ul
，10ul
，50ul
，100ul
，200
，500ul
，1000ul。

3． 振(zhèn)蕩(dàng)器及(jí)磁(cí)力(lì)攪(jiǎo)拌器等(děng)。

安全性

1． 避免直接(jiē)接觸終(zhōng)止液和底物(wù)A
，B。一(yī)旦接(jiē)觸到這些液(yè)體(tǐ)
，請盡快(kuài)用(yòng)水衝(chōng)洗。

2． 實驗(yàn)中不(bù)要(yào)吃(chī)喝(hē)
，抽煙(yān)或(huò)使(shǐ)用(yòng)化(huà)妝(zhuāng)品。

3． 不要用嘴吸(xī)取試劑(jì)盒(hé)裏的任(rèn)何(hé)成份(fèn)。

操作注意事(shì)項

1． 試劑(jì)應(yīng)按(àn)標(biāo)簽(qiān)說(shuō)明書儲存
，使(shǐ)用前恢(huī)復(fù)到室溫。稀(xī)稀過後的(dí)標準(zhǔn)品(pǐn)應丟(diū)棄(qì)
，不(bù)可保存(cún)。

2． 實(shí)驗(yàn)中(zhōng)不(bù)用(yòng)的板(bǎn)條(tiáo)應立即放回包(bāo)裝(zhuāng)袋(dài)中(zhōng)
，密封保存
，以免變(biàn)質。

3． 不用(yòng)的(dí)其它(tā)試劑應包裝好(hǎo)或(huò)蓋好。不同批(pī)號(hào)的試劑(jì)不要混(hùn)用。保(bǎo)質(zhì)前使用。

4． 使(shǐ)用(yòng)一(yī)次(cì)性的(dí)吸(xī)頭以免交(jiāo)叉汙染(rǎn)
，吸(xī)取(qǔ)終止液和底物(wù)A
，B液(yè)時
，避免(miǎn)使用帶金屬部分的加(jiā)樣(yàng)器。

5． 使(shǐ)用幹淨的(dí)塑料(liào)容器(qì)配置(zhì)洗(xǐ)滌液。使用(yòng)前(qián)充(chōng)分混(hùn)匀(yún)試(shì)劑(jì)盒裏(lǐ)的(dí)各種成(chéng)份及樣品。

6． 洗(xǐ)滌酶標板(bǎn)時應充分(fēn)拍(pāi)幹
，不要將吸水(shuǐ)紙(zhǐ)直接(jiē)放(fàng)入酶(méi)標反應(yīng)孔中(zhōng)吸水。

7． 底物A應(yīng)揮(huī)發(fā)
，避免長時間打開(kāi)蓋子(zǐ)。底物(wù)B對光敏(mǐn)感(gǎn)
，避免(miǎn)長(cháng)時(shí)間暴(bào)露於光(guāng)下。避免(miǎn)用手接觸
，有毒。實驗(yàn)完成後應立(lì)即(jí)讀取OD值。

8． 加入(rù)試劑(jì)的(dí)順序(xù)應(yīng)一(yī)致
，以保證所(suǒ)有(yǒu)反應板孔溫(wēn)育的時間一樣。

9． 按(àn)照(zhào)說(shuō)明書中標明(míng)的時(shí)間
，加(jiā)液的量及順(shùn)序進(jìn)行(háng)溫(wēn)育(yù)操作。

樣品收(shōu)集
，處理及(jí)保存方(fāng)法

1
， 血清(qīng)-----操作過(guò)程(chéng)中避免任何細胞(bāo)刺激。使用(yòng)不(bù)含熱原(yuán)和內(nèi)毒素的試管(guǎn)。收(shōu)集(jí)血液後
，1000×g離(lí)心10分(fēn)鐘(zhōng)將血(xiě)清和紅細(xì)胞迅(xùn)速小心(xīn)地分離(lí)。

2
， 血漿-----EDTA
，檸檬酸鹽
，肝素血(xiě)漿可(kě)用(yòng)於(yú)檢(jiǎn)測(cè)。1000×g離(lí)心(xīn)30分鐘(zhōng)去(qù)除顆粒(lì)。

3
， 細胞(bāo)上清液---1000×g離(lí)心(xīn)10分(fēn)鐘去除(chú)顆粒和聚合(hé)物(wù)。

4
， 保(bǎo)存(cún)------如(rú)果(guǒ)樣(yàng)品(pǐn)不(bù)立(lì)即使用
，應(yīng)將其分成(chéng)小部分-70 ℃保存
，避(bì)免(miǎn)反復冷(lěng)凍(dòng)。盡(jìn)可能的不(bù)要使用溶血或高血脂(zhī)血。如果血(xiě)清(qīng)中大量顆(kē)粒
，檢(jiǎn)測前(qián)先離心(xīn)或(huò)過(guò)濾。不要(yào)在37℃或更高(gāo)的(dí)溫度加熱解(jiě)凍。應(yīng)在(zài)室(shì)溫(wēn)下解凍並確保(bǎo)樣品均匀地充分解凍(dòng)。

試劑(jì)的準(zhǔn)備

1． 標(biāo)準品：標(biāo)準品的(dí)係列(liè)稀(xī)釋應在實驗(yàn)時(shí)準(zhǔn)備
，不能(néng)儲存(cún)。稀釋(shì)前(qián)將標準品(pǐn)振蕩混(hùn)匀。稀(xī)釋(shì)比(bǐ)例按(àn)下表中(zhōng)進行：

24 ng/ml （6號標(biāo)準品） 原倍濃度(dù)不用(yòng)稀(xī)釋(shì)直接加入(rù)50ul。

12 ng/ml （5號標準(zhǔn)品(pǐn)） 100ul的(dí)原倍標(biāo)準品(pǐn)加入(rù)100ul的(dí)標(biāo)準(zhǔn)品(pǐn)稀釋(shì)液(yè)

6.0 ng/ml （4號標準品） 100ul的(dí)5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準品(pǐn)稀(xī)釋液(yè)

3.0 ng/ml （3號標(biāo)準(zhǔn)品） 100ul的(dí)4號標(biāo)準品加(jiā)入(rù)100ul的(dí)標準品稀(xī)釋液

1.5 ng/ml （2號標(biāo)準品） 100ul的3號標(biāo)準品(pǐn)加入100ul的(dí)標(biāo)準品(pǐn)稀(xī)釋(shì)液(yè)

0.75 ng/ml （1號標準品） 100ul的2號標準(zhǔn)品(pǐn)加入(rù)100ul的標準品(pǐn)稀釋液

0 ng/ml （空(kōng)白(bái)對(duì)照） 原始濃度不用(yòng)稀釋直接加入50ul。

2． 洗(xǐ)滌(dí)緩(huǎn)衝液（50×）的稀釋：蒸餾水(shuǐ)50倍(bèi)稀釋(shì)。

操作(zuò)步驟(zhòu)

1． 使(shǐ)用前(qián)
，將所有(yǒu)試劑充(chōng)分(fēn)混匀(yún)。不(bù)要使(shǐ)液體(tǐ)產生大量(liáng)的(dí)泡(pào)沫(mò)
，以免加樣時加(jiā)入大量的氣泡(pào)
，產(chǎn)生加樣上(shàng)的(dí)誤(wù)差(chà)。

2． 根(gēn)據待(dài)測樣品數量(liáng)加(jiā)上標準品的數量決定(dìng)所(suǒ)需的(dí)板條(tiáo)數(shù)。每(měi)個標(biāo)準品和(hé)空白(bái)孔建議做復孔(kǒng)。每(měi)個樣品(pǐn)根據自(zì)己(jǐ)的數量(liáng)來(lái)定(dìng)
，能(néng)使(shǐ)用(yòng)復孔(kǒng)的盡量(liáng)做(zuò)復(fù)孔(kǒng)。

3． 加(jiā)入(rù)稀(xī)釋好(hǎo)後的(dí)標準(zhǔn)品50ul於反應(yīng)孔
，加入(rù)待測樣品(pǐn)50ul於(yú)反(fǎn)應孔內。立即加(jiā)入(rù)50ul的生物(wù)素標記(jì)的(dí)抗(kàng)體。蓋(gài)上(shàng)膜(mó)板(bǎn)
，輕(qīng)輕(qīng)振蕩(dàng)混(hùn)匀
，37℃溫(wēn)育(yù)1小時。

4． 甩去孔(kǒng)內液體
，每孔加滿洗滌液
，振蕩(dàng)30秒
，甩(shuǎi)去(qù)洗滌液
，用吸(xī)水紙(zhǐ)拍幹。重(zhòng)復此操作3次(cì)。如果用(yòng)洗板機洗滌
，洗滌(dí)次數增加一次(cì)。

5． 每孔加(jiā)入80ul的親(qīn)和鏈酶素-HRP
，輕輕振(zhèn)蕩混匀
，37℃溫育30分鐘。

6． 甩去孔(kǒng)內液體
，每孔(kǒng)加滿(mǎn)洗滌液(yè)
，振蕩30秒
，甩(shuǎi)去洗滌(dí)液(yè)
，用(yòng)吸水紙(zhǐ)拍幹(gān)。重復此(cǐ)操作(zuò)3次。如果(guǒ)用(yòng)洗板機洗滌
，洗滌(dí)次數增加一(yī)次(cì)。

7． 每(měi)孔(kǒng)加入底(dǐ)物(wù)A
，B各(gè)50ul
，輕(qīng)輕(qīng)振蕩混(hùn)匀
，37℃溫育10分鐘。避免(miǎn)光照(zhào)。

8． 取(qǔ)出酶標板
，迅(xùn)速(sù)加入(rù)50ul終(zhōng)止液
，加入終(zhōng)止液後應(yīng)立即測定結(jié)果。

9． 在450nm波(bō)長處測定各孔(kǒng)的(dí)OD值。

建議(yì)使用的實驗方案(àn)

標準(zhǔn)品濃度（ng/ml）

A 24 24 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣品 樣品

B 12 12 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品 樣品

C 6.0 6.0 樣品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品 樣品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品

D 3.0 3.0 樣品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣品 樣(yàng)品 樣品(pǐn)

E 1.5 1.5 樣(yàng)品 樣品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn)

F 0.75 0.75 樣品(pǐn) 樣品 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品(pǐn) 樣(yàng)品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣(yàng)品

G 0 0 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn) 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品(pǐn)

H 樣品(pǐn) 樣品 樣品 樣品 樣品(pǐn) 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn) 樣品 樣品 樣(yàng)品 樣(yàng)品 樣(yàng)品(pǐn)

局限

6號標(biāo)準品(pǐn)以(yǐ)上(shàng)的結(jié)果為(wéi)非綫(xiàn)性的
，根(gēn)據此(cǐ)標準(zhǔn)曲(qū)綫(xiàn)無(wú)法(fǎ)得(dé)到的結果。

試劑(jì)盒性能(néng)

1. 靈敏度：zui小的檢(jiǎn)測(cè)濃度小(xiǎo)於1號(hào)標準(zhǔn)品(pǐn)。稀釋度的綫(xiàn)性。樣(yàng)品(pǐn)綫性回(huí)歸(guī)與預期(qī)濃(nóng)度相關係數R值為(wéi)0.990。

2. 特(tè)異性(xìng)：不與其(qí)它細胞因子(zǐ)反應(yīng)。

3. 重復性(xìng)：板內(nèi)
，板(bǎn)間變(biàn)異係(xì)數均小於10%。

結 果 判(pàn) 斷(duàn) 與 分 析

1
，儀器值(zhí)：於波長(cháng)450nm的酶標儀上讀取(qǔ)各孔的(dí)OD值(zhí)

2
，以(yǐ)吸(xī)光(guāng)度(dù)OD值為(wéi)縱坐標（Y）
，相(xiāng)應的(dí)TRH標準品(pǐn)濃度(dù)為橫坐標(biāo)（X）
，做(zuò)得相應的曲綫
，樣品(pǐn)的(dí)TRH含(hán)量可(kě)根據其(qí)OD值由標準(zhǔn)曲綫換算(suàn)出相應(yīng)的(dí)濃(nóng)度。

3
，檢測值範圍(wéi)：0-24ng/ml

4
，敏感度： 0.1 ng/ml